連鎖球菌属を培養するための発酵プロセスおよび連鎖球菌属由来の莢膜多糖（ｃｐ）を得るための精製プロセス

专利摘要:
莢膜多糖（ｃｐ）は、種々の細菌性疾患に関与している細菌の表面上に見られる重要な免疫原である。この特徴により、莢膜多糖は、ワクチンの設計において重要な成分となっている。莢膜多糖は、特に、担体タンパク質と連結させると、免疫応答の誘起に有用であることが示されている。本発明は、細菌培養の分野におけるものであり、特に、フィードバッチ式培養における連鎖球菌属菌株からの細菌莢膜多糖の生産を改善するための培養条件の最適化、および連鎖球菌属菌株からの細菌莢膜多糖の生産規模精製に適し、これまでの生産規模で得られるものより高い純度レベルがもたらされる新規な精製方法に関する。
公开号:JP2011507501A
申请号:JP2010538947
申请日:2008-12-19
公开日:2011-03-10
发明作者:ロベルト オリビエリー，；パオロ コスタンチーノ，；コンセッタ；マリア シカラ，；フランチェスコ ノレーリー，；ジュリア バゾッキー，；シルビア フォンタニ，；フランチェスコ ベルチ，
申请人:ノバルティス アーゲー；
IPC主号:C12N1-20

专利说明:

[0001] 本願は、２００７年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／００８，９４１号および２００８年１０月８日に出願された英国特許出願第０８１８４５３．３号の利益を主張する。米国仮特許出願第６１／００８，９４１号および英国特許出願第０８１８４５３．３号の両方は、その全体が参考により本明細書中に援用される。]
[0002] 発明の分野
本発明は、細菌培養の分野におけるものであり、好ましくは、細菌莢膜多糖の生産を改善するための培養条件の最適化および新規な精製方法に関する。]
背景技術

[0003] 発明の背景
莢膜多糖（ｃｐ）は、種々の細菌性疾患に関与している細菌の表面上に見られる重要な免疫原である。この特徴により、莢膜多糖は、ワクチンの設計において重要な成分となっている。莢膜多糖は、特に、担体タンパク質と連結させると、免疫応答の誘起に有用であることが示されている（参考文献１）。]
[0004] 典型的には、莢膜多糖は、複合培地中でのバッチ式培養（Ｂ群連鎖球菌属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、フィードバッチ式培養（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）または連続式培養（Ｂ群連鎖球菌属およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）を用いて生産させる（参考文献２〜７）。ほとんどの研究では、インキュベーション中に増殖速度、栄養素レベルおよび代謝濃度が変化するバッチ式培養系が使用された。かかる系では、１つの要素の変化により、増殖と関連している他の要素の変化がもたらされ、これが、予測不可能に収率に影響することがあり得る。連続式培養では、研究者が、バッチ式培養での増殖中、相互依存性のパラメータ（増殖速度、栄養素および生成物濃度ならびに菌体密度など）を分離および規定することが可能である。連続式培養の際は、新鮮培地が培養物に一定速で添加され、菌体および培地が、一定の培養容量が維持される速度で除去される。連続式培養は、条件に依存性である場合では、莢膜多糖の生産に好ましいものであった（参考文献８）。]
[0005] Ｂ群連鎖球菌属（ＧＢＳ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）では、菌体増殖速度が莢膜多糖の生産が調節される主要な要素であると報告された。さらに、ＩＩＩ型莢膜多糖の生成は、増殖制限栄養素とは独立して起こり得ることが示された。菌体を高速（０．８、１．４または１．６時間）の質量倍加時間（ｔｄ）で保持した方が、低速の場合（ｔｄ＝２．６または１１時間）よりも高い比収率（約９０ｍｇ／ｇＣＤＷ）が得られた（参考文献８〜１０）。しかしながら、連続式培養は、菌株の安定性の問題および汚染を有する傾向にあり、培地と栄養素を連続的に供給するため、いくぶん費用がかかる。したがって、上記の連続式培養に伴う問題を解決するため、莢膜多糖の高収率生産のための連続式培養の代替法を見い出すことが必要である。]
[0006] 連続式培養の問題点を解決するためのアプローチの一例は、ＷＯ２００７／０５２１６８に例示されている。ｃｐ生産に都合のよい栄養環境および増殖速度を維持するための複雑なフィードバッチ式発酵プロセスが開発された。このプロセスは、バッチ手法の利点と連続式手法の利点を併せ持ち、指数増殖期の長期化および発酵時の基質添加を制御する条件のため、高い菌体密度がもたらされる。しかしながら、この複雑なフィードバッチ式手法では、発酵を管理するための複雑なアルゴリズムを伴うソフトウェアを使用する。さらに、臨床試験をサポートするための物質を作製するためには、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）に準拠したロバストで費用効果の高い生産プロセスが必要である。したがって、大規模生産用のフィードバッチ式発酵プロセスを単純化することが差し迫って必要である。]
[0007] 発酵プロトコルの単純化の必要性に加え、発酵後の莢膜多糖の大規模生産に使用され得る単純化された精製プロトコルが必要である。ＷＯ２００７／０５２１６８に例示されたアプローチは、抽出、アルコール沈殿、ダイアフィルトレーション、カチオン系デタージェント処理および再可溶化を含む、ＷＯ２００６／０８２５２７に開示された方法に基づいたものである。この手順は非常に効率的であり、典型的にはおよそ８０％純粋な莢膜多糖の調製がもたらされる。しかしながら、カチオン系デタージェント処理工程で莢膜多糖を沈殿させる。その後の上清みからの沈殿物の分離（例えば、遠心分離による）および再可溶化は困難であり、莢膜多糖のロスが生じることがあり得、それにより収率が低下し得る。また、カチオン系デタージェント処理の効率は莢膜多糖の初期純度に依存し得る。莢膜多糖の初期純度が低いほど、カチオン系デタージェント処理の効率は低くなり得、さらに収率が制限される。したがって、精製工程の複雑さおよび／または費用が少なくて高純度レベルがもたらされる単純化された精製手順が必要である。また、多糖がどのような初期純度であっても良好な収率の莢膜多糖が得られる精製手順が必要である。]
課題を解決するための手段

[0008] 開示する実施形態の概要
本発明者らは、製造規模で連鎖球菌属から莢膜多糖（ｃｐ）を生産するための方法を提供することにより、発酵プロトコルの単純化のための必要性を満たした。一部の特定の実施形態において、炭素源の線形添加時のｐＨ平衡化のためのアルゴリズムが排除され、他の実施形態では、培地の不必要な成分が除外された。連鎖球菌属の好ましい種はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅであり、これは、ランスフィールドのＢ群連鎖球菌属またはＧＢＳ、特に、菌株０９０、Ｈ３６ｂ、ＣＢＪ１１１、もしくはＭ７８１とも称される。]
[0009] 一態様により、ｃｐを発現する連鎖球菌属菌株の播種材料を提供する。一実施形態において、播種材料の光学密度（ＯＤ）は、好ましくは０．６〜１．８であり、これは、播種材料の対数増殖中期である。報告するＯＤ値は５９０ｎｍにおいて測定したものであるが、ＯＤは、所与の実験の吸光度波長に基づいて変換され得る。]
[0010] 別の態様により、発酵による連鎖球菌属菌株の培養方法を提供する。一実施形態において、培養時の培養培地のｐＨは６．０〜７．５、好ましくは約７．３である。別の実施形態において、培養時の培養培地の温度は３４〜３８℃、好ましくは約３６℃である。]
[0011] 別の態様により、酵母抽出物の２回の即時添加後、炭素源の線形添加を含む、連鎖球菌属菌株の培養方法を提供する。線形添加に好ましい炭素源はグルコースである。各添加は、細菌増殖速度を調節することによってｃｐの高容積生産が達成されるように、および最大の血清型特異的ｃｐが生産されるよう微生物を適応させるために選択された指定ＯＤレベルで開始される。]
[0012] 一実施形態において、酵母抽出物の第１の即時添加は、２．８〜３．２、好ましくは約３．０のＯＤレベルで開始される。別の実施形態において、酵母抽出物の第２の即時添加は、４．３〜４．７、好ましくは約４．５のＯＤレベルで開始される。別の実施形態において、炭素源の線形添加は、９．８〜１０．０、好ましくは約１０のＯＤレベルで開始される。]
[0013] 全般的に、アルゴリズムなしでの炭素源の線形添加は、培養培地のｐＨをモニタリングすることにより培養を制御するためアルゴリズムを使用する以前の複雑なフィードバッチ式発酵プロセスと比べた改善点である。]
[0014] 別の態様により、規定培地または複合培地を含む培養培地を提供する。規定培地は、リン酸源、ミネラル源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む。ビタミン源は、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される６種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない。]
[0015] 複合培地は、複合抽出物（好ましくは酵母抽出物）、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む。ビタミン源は、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される４種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない（すなわち、５種類のうち４種類は培地に含まれるが、５種類目は、複合抽出物の天然成分として添加されない（ｏｔｈｅｒｔｈａｔ））。好ましい実施形態において、ビタミン源は３種類以下、２種類以下、またはビオチンのみを有する。]
[0016] さらに、本発明は、リン酸源、ミネラル源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源で構成された規定培地である培養培地を含む組成物を提供する。この場合もまた、好ましい連鎖球菌属菌株はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、特に、菌株０９０、Ｈ３６ｂ、ＣＢＪ１１１、またはＭ７８１である。一実施形態において、リン酸源は、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４・Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、またはＮａＣｌからなる。一実施形態において、好ましい炭素源はグルコースである。]
[0017] 別の実施形態において、ビタミン源は、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される６種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない。]
[0018] 別の実施形態では、ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの５種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない。]
[0019] 別の実施形態では、ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの４種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない。]
[0020] 別の実施形態では、ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの３種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない。]
[0021] 別の実施形態では、ビタミン源が、パントテン酸カルシウムとナイアシンアミドからなる。]
[0022] 別の実施形態において、アミノ酸源は、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１９種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない。]
[0023] 別の実施形態では、アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１８種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない。]
[0024] 別の実施形態では、アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１７種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない。]
[0025] 別の実施形態では、アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１６種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない。]
[0026] 別の実施形態では、アミノ酸源が、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンからなる。]
[0027] 別の態様により、複合抽出物（好ましくは酵母抽出物）、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源で構成された複合培地である培養培地を含む組成物を提供する。この場合もまた、好ましい連鎖球菌属菌株はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、特に、菌株０９０、Ｈ３６ｂ、ＣＢＪ１１１、またはＭ７８１である。]
[0028] 一実施形態において、ビタミン源は、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される４種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない。]
[0029] 別の実施形態では、ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される３種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない。]
[0030] 別の実施形態では、ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される２種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない。]
[0031] 別の実施形態では、ビタミン源がビオチンである。]
[0032] 前述の態様および実施形態は、互いに排他的であることを意図せず、互いに組み合わされ得、互いに排他的である範囲（ｔｏ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｄ）を除き、任意の他の態様または実施形態が本明細書において開示される。]
[0033] さらに、本発明は、付着性フィルターを用いた濾過工程を含む、典型的にはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅからの莢膜多糖の精製方法を提供する。付着性フィルターは、莢膜多糖中に存在し得る夾雑物（例えば、タンパク質および／または核酸）と結合するが、莢膜多糖が該フィルターを通過すること可能である。本発明者らは、莢膜多糖を精製するために、ＷＯ２００７／０５２１６８およびＷＯ２００６／０８２５２７に記載のカチオン系デタージェント処理の代わりに、付着性フィルターが使用され得ることを見い出した。付着性フィルターの使用により、カチオン系デタージェントを適用する必要がなくなり、これは、該方法のこの段階において莢膜多糖の沈殿を行なわないことを意味する。これにより、上清みから沈殿物を分離する必要がなくなり、該方法が単純化され、この分離時に起こり得る莢膜多糖のロス（あれば）が抑制される。したがって、付着性フィルターの使用により、精製方法の収率が改善され得る。また、付着性フィルターの効率は、莢膜多糖の初期純度に対する依存性が低い。]
[0034] 当業者には、この方法における使用のための適当な付着性フィルターを特定することが可能である。典型的には、莢膜多糖中の主な夾雑物はタンパク質であり、したがって、付着性フィルターはタンパク質付着性フィルターである。本発明者らは、カーボンフィルターが特に適していることを見い出した。これは、典型的には活性炭（例えば、粒状炭素床として、または圧縮もしくは押出カーボンブラックとして）で構成されており、試料精製のためのフィルターとしての機能を果たす。]
[0035] 当業者には、適当なカーボンフィルター特定することが可能である。典型的には、本発明における使用のためのカーボンフィルターは、マトリックス内に固定化された活性炭を含むものである。マトリックスは、試料に対して透過性である任意の多孔質フィルター媒体であり得る。マトリックスは、支持体物質および／または結合体物質を含むものであってもよい。支持体物質は、合成ポリマーまたは天然起源のポリマーであり得る。好適な合成ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリアクリルアミドおよびポリメタクリル酸メチルが挙げられ得、一方、天然起源のポリマーとしては、セルロース、多糖類およびデキストラン、アガロースが挙げられ得る。典型的には、ポリマー支持体物質は、機械的剛性をもたらす繊維網目の形態である。結合体物質は樹脂であり得る。マトリックスは、膜シートの形態を有するものであってもよい。典型的には、マトリックス内に固定化された活性炭は、カートリッジの形態であり得る。カートリッジは、マトリックス内に固定化され、膜シートの形態に作製された粉末活性炭を内包する内蔵式の存在体である。膜シートは、プラスチックの透過性支持体内に保持され、ディスクを形成したものであってもよい。あるいはまた、膜シートをらせん状に巻き上げてもよい。フィルター表面積を大きくするため、いくつかのディスクを互いの上に積層してもよい。特に、互いの上に積層したディスクは、炭素処理された試料をフィルターから回収し、取り出すための中心コアパイプを有する。積層ディスクの構成は、半円筒形であってもよい。カーボンフィルター内の活性炭は、種々の原料、例えば、泥炭、亜炭、木材またはココナッツの殻に由来するものであり得る。当該技術分野で知られた任意の方法（水蒸気処理または化学的処理など）が炭素の活性化に使用され得る。本発明において、マトリックス内に固定化された活性炭をハウジング内に配置し、独立したフィルターユニットを形成してもよい。各フィルターユニットは、個々に精製対象試料の供給口および排出口を有する。本発明において使用され得るフィルターユニットの例は、Ｃｕｎｏ Ｉｎｃ．（Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＵＳＡ）製またはＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌ，ＵＳＡ）製の炭素カートリッジである。]
[0036] 特に、本発明者らは、ＣＵＮＯ ｚｅｔａｃａｒｂｏｎＴＭフィルターが本発明における使用に適していることを見い出した。このカーボンフィルターは、活性炭粉末が内部に封入され、所定の位置で樹脂に結合されたセルロースマトリックスで構成されている。]
[0037] 本発明のこの態様の方法のための出発材料は、以下の「出発材料」という標題のセクションに記載の出発材料の１つであり得る。この方法には、さらに、以下の「アルコール沈殿およびカチオン交換」、「ダイアフィルトレーション」、「再−Ｎ−アセチル化」、「さらなるダイアフィルトレーション」、「コンジュゲートの作製」および／または「他の工程」という標題のセクションに記載の工程の１つ以上を含めてもよい。したがって、典型的な工程シーケンスは、ｉ）「アルコール沈殿およびカチオン交換」という標題のセクションに記載の工程（１つまたは複数）；ｉｉ）セクション「ダイアフィルトレーション」に記載の工程（１つまたは複数）；ｉｉｉ）上記の付着性フィルターを用いた濾過工程；ｉｖ）「再−Ｎ−アセチル化」という標題のセクションに記載の工程（１つまたは複数）；およびｖ）「さらなるダイアフィルトレーション」という標題のセクションに記載の工程（１つまたは複数）であり得る。次いで、このプロセスの後、「コンジュゲートの作製」という標題のセクションに記載の工程（１つまたは複数）を続けてもよい。最後に、このプロセスの後、「他の工程」という標題のセクションに記載の工程（１つまたは複数）を続けてもよい。]
[0038] 該方法には、さらに、以下の「カチオン系デタージェント処理」および「再可溶化」という標題のセクションに記載の工程の１つ以上を含めてもよいが、典型的には、これらの工程は、濾過が本発明の方法において付着性フィルターを用いて行なわれる場合、莢膜多糖を沈殿させるためのカチオン系デタージェント処理、およびその後の該多糖の再可溶化が一般的には必要とされないため、省略される。したがって、本発明では、具体的に、付着性フィルターを用いた濾過工程を含み、莢膜多糖を沈殿させるためのカチオン系デタージェント処理工程、その後の莢膜多糖の再可溶化工程を含まない、典型的にはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅからの莢膜多糖の精製方法が想定される。]
[0039] さらに、本発明はまた、製造規模での連鎖球菌属からの莢膜多糖（ｃｐ）の精製方法を提供する。連鎖球菌属の好ましい種はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅであり、これは、ランスフィールドのＢ群連鎖球菌属またはＧＢＳ、特に、菌株０９０、Ｈ３６ｂ、ＣＢＪ１１１、もしくはＭ７８１とも称される。]
[0040] 好ましい実施形態において、精製莢膜多糖の生産方法は、以下の工程：（ａ）莢膜多糖を含む粗製分離株を準備する工程；（ｂ）該粗製分離株をアルコール溶液と接触させることによって形成されたアルコール沈殿物を取り出す工程；（ｃ）莢膜多糖を保持したまま低分子量化合物を除去するために濾過する工程；および（ｄ）タンパク質付着性フィルターを用いてタンパク質夾雑物を除去し、精製莢膜多糖を得る工程の１つ以上を含む。好ましい実施形態において、該方法は前述の工程のすべてを含む。より好ましい実施形態において、方法では、デタージェント沈殿が省略される。]
[0041] 一部の特定の実施形態において、１つ以上のさらなる工程、例えば、（ｅ）精製莢膜多糖を再−Ｎ−アセチル化する工程、（ｆ）精製莢膜多糖を沈殿させる工程；および／または（ｇ）莢膜多糖を一成分として有するワクチンを製剤化する工程が行なわれ得る。]
[0042] 一部の特定の実施形態において、アルコール溶液は、核酸夾雑物を沈殿させるが莢膜多糖は沈殿させないのに充分な濃度まで添加される。好ましい実施形態において、アルコールはエタノールであり、好ましくは約１０％〜約５０％のエタノール濃度まで、より好ましくは約３０％のエタノール濃度まで添加される。アルコール溶液は、任意選択でカチオン、好ましくは金属カチオン、より好ましくは二価カチオン、最も好ましくはカルシウムを含むものであり得る。]
[0043] 一部の特定の実施形態（ｅｍｂｏｄｉｅｍｅｎｔ）において、タンパク質付着性フィルターは活性炭フィルターである。]
図面の簡単な説明

[0044] 図１は、潜在的なＧＢＳワクチン標的である莢膜多糖を示す。
図２は、莢膜多糖（ｃｐ）とＧＢＳのＢ群炭水化物の結合の提案モデルの概略図である。
図３Ａは、Ｉａ型およびＩｂ型に由来するＧＢＳの血清型特異的ｃｐの分子構造を示す。図３Ｂは、ＩＩＩ型およびＶ型に由来するＧＢＳの血清型特異的ｃｐ分子構造を示す。
図３Ａは、Ｉａ型およびＩｂ型に由来するＧＢＳの血清型特異的ｃｐの分子構造を示す。図３Ｂは、ＩＩＩ型およびＶ型に由来するＧＢＳの血清型特異的ｃｐ分子構造を示す。
図４は、ＧＢＳに対する複合糖質ワクチンの作製プロセスを示す。
図５Ａ〜Ｄは、（Ａ）０９０菌株、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株、（Ｃ）Ｍ７８１菌株、および（Ｄ）ＣＪＢ１１１の増殖曲線および培地のｐＨを示す。０．１〜２．４の範囲のＯＤ値を用いて比増殖速度を計算した。
図５Ａ〜Ｄは、（Ａ）０９０菌株、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株、（Ｃ）Ｍ７８１菌株、および（Ｄ）ＣＪＢ１１１の増殖曲線および培地のｐＨを示す。０．１〜２．４の範囲のＯＤ値を用いて比増殖速度を計算した。
図５Ａ〜Ｄは、（Ａ）０９０菌株、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株、（Ｃ）Ｍ７８１菌株、および（Ｄ）ＣＪＢ１１１の増殖曲線および培地のｐＨを示す。０．１〜２．４の範囲のＯＤ値を用いて比増殖速度を計算した。
図５Ａ〜Ｄは、（Ａ）０９０菌株、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株、（Ｃ）Ｍ７８１菌株、および（Ｄ）ＣＪＢ１１１の増殖曲線および培地のｐＨを示す。０．１〜２．４の範囲のＯＤ値を用いて比増殖速度を計算した。
図６は、（Ａ）０９０菌株の増殖曲線、（Ｂ）０９０菌株によるｃｐ濃度、および（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量を示し、ここで、増殖速度は、水酸化ナトリウムとメタノール中のビオチンと４種類のビタミン；リボフラビンなしの水中のビオチンと３種類のビタミン；ビオチンのみ；およびビタミンなしについて測定した。
図７は、（Ａ）Ｈ３６ｂ菌株の増殖曲線、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株によるｃｐ濃度、および（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量を示し、ここで、増殖速度は、水酸化ナトリウムとメタノール中のビオチンと４種類のビタミン；リボフラビンなしの水中のビオチンと３種類のビタミン；およびビオチンのみについて測定した。
図８は、（Ａ）Ｍ７８１菌株の増殖曲線、（Ｂ）Ｍ７８１菌株によるｃｐ濃度、および（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量を示し、ここで、増殖速度は、水酸化ナトリウムとメタノール中のビオチンと４種類のビタミン；リボフラビンなしの水中のビオチンと３種類のビタミン；およびビオチンのみについて測定した。
図９は、ＣＪＢ１１１菌株の増殖曲線、ＣＪＢ１１１菌株によるｃｐ濃度、および乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量を示し、ここで、増殖速度は、ビオチン単独について測定した。
図１０は、（Ａ）０９０菌株の増殖曲線、（Ｂ）０９０菌株によるｃｐ濃度、および（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量を示し、ここで、増殖速度はフィードバッチ手法；ＯＤレベルが３と５の場合の酵母抽出物の即時添加後、グルコースの線形添加；およびバッチ用培地中への全酵母抽出物の添加後、グルコースの線形添加について測定した。
図１１は、（Ａ）Ｈ３６ｂ菌株の増殖曲線、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株によるｃｐ濃度、および（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量を示し、ここで、増殖速度は、フィードバッチ手法；ＯＤレベルが３と５の場合の酵母抽出物の即時添加後、グルコースの線形添加；およびバッチ用培地中への全酵母抽出物の添加後、グルコースの線形添加について測定した。
図１２は、（Ａ）Ｍ７８１菌株の増殖曲線、（Ｂ）Ｍ７８１菌株によるｃｐ濃度、および（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量を示し、ここで、増殖速度は、フィードバッチ手法；ＯＤレベルが３と５の場合の酵母抽出物の即時添加後、グルコースの線形添加；およびバッチ用培地中への全酵母抽出物の添加後、グルコースの線形添加について測定した。
図１３は、ＣＪＢ１１１菌株の増殖曲線、ＣＪＢ１１１菌株によるｃｐ濃度、および乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量を示し、ここで、増殖速度は、ＯＤレベルが３と５の場合の酵母抽出物の即時添加後、グルコースの線形添加について測定した。
図１４は、ＤＯＴ試験の結果を示し、（Ａ）１５％、３０％および６０％におけるＨ３６ｂ菌株の増殖曲線、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株によるｃｐ濃度、（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量、ならびに（Ｄ）Ｈ３６ｂ菌株の平均生産性を示す。
図１５は、温度試験の結果を示し、（Ａ）３４℃、３６℃および３８℃におけるＨ３６ｂ菌株の増殖曲線、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株によるｃｐ濃度、（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量、ならびに（Ｄ）Ｈ３６ｂ菌株の平均生産性を示す。
図１６は、ｐＨ試験の結果を示し、（Ａ）７．０、７．３および７．５におけるＨ３６ｂ菌株の増殖曲線、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株によるｃｐ濃度、（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量、ならびに（Ｄ）Ｈ３６ｂ菌株の平均生産性を示す。
図１７は、圧力試験の結果を示し、（Ａ）０．２および０．５バールにおけるＨ３６ｂ菌株の増殖曲線、（Ｂ）Ｈ３６ｂ菌株によるｃｐ濃度、（Ｃ）乾燥菌体重量グラムあたりのｃｐ生産量、ならびに（Ｄ）Ｈ３６ｂ菌株の平均生産性を示す。
図１８は、（Ａ）１００ｍＬの化学的に規定される培地（０．１ｍＬのｗ．ｓ．）を入れた５００ｍＬ容三角フラスコ、および（Ｂ）２Ｌ容発酵槽におけるＭ７８１菌株の増殖曲線を示す。０．１〜０．７の範囲のＯＤ値を用いて比増殖速度を計算した。
図１９は、標準的なバッチ用培地；ビタミンの量の１０倍；アミノ酸とビタミンの量の１０倍；ならびにビタミン、アミノ酸およびカリウムの量の１０倍について、プロットグラフとして、Ｍ７８１菌株の増殖曲線、棒グラフとして、グルコース消費量を示す。
図２０は、規定培地でのＧＢＳの菌株Ｍ７８１の増殖に対するアラニン、アスパラギン酸、グルタミンおよびプロリンの除外の効果を示す。
図２１は、規定培地でのＧＢＳの菌株Ｍ７８１の増殖に対するビオチン、葉酸、ピリドキシン、リボフラビンおよびチアミンの除外の効果を示す。
図２２は、研究室規模での３種類の菌株、Ｍ７８１、Ｈ３６ｂおよび０９０の第１の予備試験発酵操作のＯＤ５９０ｎｍプロフィールを示す。
図２３は、単純化プロセスを用いた４種類の菌株、Ｍ７８１、Ｈ３６ｂ、０９０およびＣＪＢ１１１の第２の予備試験発酵操作のＯＤ５９０ｎｍプロフィールを示す。第１の単純化では、チアミン、リボフラビン、ピリドキシンＨＣｌ、およびナイアシンアミドをビタミン溶液から除去した。第２の単純化は、発酵時のフィード相のパラメータの変更とした。
図２４は、４種類の菌株、Ｍ７８１、Ｈ３６ｂ、０９０、ＣＪＢ１１１の試験発酵操作のＯＤ５９０ｎｍプロフィールを示す。
図２５は、２５℃において記録した精製ＧＢＳ Ｉａ型多糖の１ＨＮＭＲスペクトルを示す。一部水素がスペクトル上で確認される。
図２６は、２５℃において記録した精製ＧＢＳ Ｉｂ型多糖の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。一部水素がスペクトル上で確認される。
図２７は、２５℃において記録した精製ＧＢＳ ＩＩＩ型多糖の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。一部水素がスペクトル上で確認される。
図２８は、２５℃において記録した精製ＧＢＳ Ｖ型多糖の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。一部水素がスペクトル上で確認される。
図２９は、０．５μｇ／ｍＬにおける多糖試料およびシアル酸標準（灰色線）の溶出プロフィールのオーバーレイを示す。
図３０は、多糖試料およびラムノースを添加した多糖試料（灰色線）の溶出プロフィールのオーバーレイを示す。] 図１ 図１０ 図１１ 図１２ 図１３ 図１４ 図１５ 図１６ 図１７ 図１８
[0045] 好ましい実施形態の詳細な説明
本発明者らは、製造規模での高収率のｃｐが、任意の連鎖球菌属菌株でフィードバッチ式培養、すなわち、有限容量の新鮮培地中への菌体播種によって開始され、該菌体を培養した後、１回の回収によって終結され、付加的な栄養素は、最初の供給源の栄養素を消費させてから培養物に添加する培養を用いて得られ得ることを見い出した。かかる高収率は、連続式培養を用いて得られるものと同等であるか、またはより良好である。さらに、本明細書において開示した方法は、連続式培養の安定性と汚染の問題を有する傾向がない。さらに、本発明者らは、不純物が有意に改善されるとともに、プロトコルが単純で製造規模が廉価に維持される最適化精製プロトコルを開発した。]
[0046] 本開示により、連鎖球菌属を培養するためのプロセスであって、連鎖球菌属をフィードバッチ式培養で培養するプロセスを提供する。連鎖球菌属の一部の特定の菌株は、培養中に生産されるｃｐが典型的には低レベルであるため、ｃｐの「不良産生菌株（ｂａｄ ｐｒｏｄｕｃｅｒ）」であることが知られている。かかる不良産生菌株の例としては、ＧＢＳ菌株ＤＫ２１および２６０３が挙げられる。しかしながら、本明細書において開示した方法を使用すると、ｃｐの生産レベルが低いことがわかっているかかる菌株からでさえも高レベルのｃｐが得られ得る。したがって、本発明は、「不良産生菌株」の場合、バッチ式または連続式培養条件下で、該菌株によって＜３０ｍｇ ｃｐ／ｇＣＤＷまたは＜１０ｍｇ ｃｐ／ｇＣＤＷが生産され得る、フィードバッチ式培養において連鎖球菌属を培養することを含む、連鎖球菌属菌株からのｃｐ収率の増大方法を提供する。]
[0047] 好ましくは、本発明は、高収率のｃｐが生産されるフィードバッチ式培養での連鎖球菌属の培養方法を提供する。好ましくは、ｃｐの収率は、不良産生菌株の場合では１０ｍｇ／ｇＣＤＷ以上（好ましくは１５、２０、２５、または３０またはそれ以上）であり、他の菌株の場合では３０ｍｇ／ｇＣＤＷ以上（好ましくは４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００またはそれ以上）である。好ましくは、培養培地からのｃｐの収率は、１０ｍｇ／Ｌ以上（例えば、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００またはそれ以上）である。より好ましくは、培養培地からのｃｐの収率は５０ｍｇ／Ｌ以上（例えば、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０またはそれ以上）である。したがって、本発明により、連続式培養と比べて単位容積あたりの収率がさらに高いｃｐの生産が可能となる。場合によっては、単位容積あたりの収率は、連続式培養を用いて生産される量の少なくとも２倍、より好ましくは連続式培養を用いて生産される量の２．５倍または３倍であり得る。]
[0048] また、本発明は、酵母抽出物の２回の即時添加後、炭素源の線形添加を含み、好ましくは、ｐＨをモニタリングするためのアルゴリズムの使用を伴わない、発酵による連鎖球菌属菌株の培養方法を提供する。線形添加に好ましい炭素源はグルコースである。各添加は、細菌増殖速度を調節することによってｃｐの高容積生産が達成されるように、および最大の血清型特異的ｃｐが生産されるよう微生物を適応させるために選択される指定ＯＤレベルで開始される。]
[0049] 一実施形態において、酵母抽出物の第１の即時添加は、２．８〜３．２、好ましくは約３．０のＯＤレベルで開始される。別の実施形態において、酵母抽出物の第２の即時添加は、４．３〜４．７、好ましくは約４．５のＯＤレベルで開始される。別の実施形態において、炭素源の線形添加は、９．８〜１０．０、好ましくは約１０のＯＤレベルで開始される。]
[0050] 全般的に、炭素源の線形添加は、培養培地のｐＨをモニタリングすることにより培養を制御するためアルゴリズムを使用する以前の複雑なフィードバッチ式発酵プロセスと比べた改善点である。]
[0051] 培養後、細菌に、ｃｐを精製するため、およびこれを担体タンパク質にコンジュゲートするためのさらなる処理工程を行なってもよい。したがって、本発明は、さらに、細菌からｃｐを精製する工程、および莢膜糖を担体タンパク質にコンジュゲートしてタンパク質−糖コンジュゲートを得る工程（図１〜２参照）を含むものであってもよい。精製ｃｐに、医薬調製物を調製するためのさらなる処理工程を行なってもよい。好ましい実施形態において、精製は、本明細書に開示した改善された精製プロトコルを用いて行なわれる。] 図１ 図２
[0052] 連鎖球菌属
用語「連鎖球菌属」は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）およびＳ．ｍｕｔａｎｓから選択され得る細菌をいう。あるいはまた、連鎖球菌属は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＳ．ｌａｃｔｉｓであってもよい。好ましくは、連鎖球菌属はＧＢＳである。使用される連鎖球菌属がＧＢＳである場合、好ましくは、選択される血清型は１ａ、１ｂ、３、４または５である。好ましくは、使用されるＧＢＳ菌株は０９０（１ａ）、７３５７（１ｂ）、Ｈ３６ｂ（１ｂ）、ＤＫ２１（２）、Ｍ７８１（３）、２６０３（５）、またはＣＪＢ１１１（５）である。図３Ａ〜Ｂ参照。使用される連鎖球菌属がＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである場合、好ましくは、選択される血清型は、４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆのうちの１種類以上または全部である。また、好ましくは血清型１が選択され得る。好ましくは、選択される血清型は、１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆの１種類以上または全部である。] 図１０ 図１１ 図１２ 図１３ 図１４ 図１５ 図１６ 図１７ 図１８ 図１９
[0053] さらに、本発明の方法を用いて培養物は均一であってもよく（すなわち、連鎖球菌属の単一の菌種または菌株からなる）、不均一であってもよい（すなわち、連鎖球菌属の２種類以上の菌種または菌株を含む）。好ましくは、培養物は均一である。]
[0054] 使用される連鎖球菌属は、野生型菌株であってもよく、遺伝的に修飾されたものであってもよい。例えば、これは、非天然の莢膜多糖もしくは異種多糖が生産されるように、または収率が増大するように修飾され得る。]
[0055] 生産プロセスの概要
ＧＢＳの生産は、４つの部：（１）各ｃｐの発酵による生産とその一次回収；（２）精密濾過の透過物の精製；（３）乾燥精製ｃｐの構築；および（４）複合糖質生体分子の特性評価に分けられ得る。]
[0056] 第１の工程は、パイロット規模の発酵ホールにおいて最適化され得、発酵によるバイオマスの生産、バイオマスの連続流遠心分離、ペレット（あるいは菌体ペースト）の回収、微生物の不活化とｃｐの放出、および回収透過物と菌体ペーストの最終の精密濾過からなる。発酵は、（１）播種材料の調製、（２）発酵、バイオマスの遠心分離、ペレットの化学的処理およびペレットの精密濾過（図４に表示）からなる。] 図４
[0057] 本発明は製造規模でのｃｐの作製方法を提供し、該方法は、ｃｐを発現する連鎖球菌属菌株の播種材料を準備するための方法、該菌株を発酵によって培養するための方法を含む。該培養は、培養培地のｐＨをモニタリングすることにより培養を制御するアルゴリズムとは反対に、ＯＤが指定の添加レベルに達したら、酵母抽出物の２回の即時添加後、培養培地への炭素源の線形添加が促されるような培養培地の光学密度（ＯＤ）のモニタリングからなる。]
[0058] 播種材料の培養
播種材料の培養は、１２１℃でオートクレーブを用いて滅菌した振盪フラスコ内で行なわれ得る。播種材料には、複合培地（酵母抽出物、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、およびグルコース一水和物（中性ｐＨおよそ７．３を有する）からなる）、ビタミン溶液（ＮａＯＨ中に希釈したチアミン、リボフラビン、ピリドキシンＨＣｌ、およびナイアシンアミドからなる）、およびビオチン溶液が含まれる。好ましい実施形態において、ビタミン溶液は除外され、ビオチン溶液がビタミン補給物として使用される。]
[0059] 好ましい実施形態において、各フラスコには、２．７５±０．２５ｍＬの作業種菌株が播種される。培養物は、およそ３５℃で、およそ２００ｒｐｍでの攪拌下、インキュベータ内におよそ４時間維持される。この期間後、バイオマス濃度を、５９０ｎｍにおけるＯＤを測定し、グラム染色を行なうことをことにより評価した。ＯＤ５９０ｎｍの値がおよそ０．６〜１．８である場合、およびグラム染色によってグラム陽性球菌のみが得られる場合、フラスコの内容物を、発酵槽のインキュベーションラインに接続された熱滅菌したビン内にプールする。]
[0060] 播種材料の調製時、好ましい条件は以下のとおり：培地の初期ｐＨは７．３±０．１であり、作業種菌株の容量は２．５〜３．０ｍＬ／フラスコであり、インキュベーション温度は３５±１℃であり、攪拌速度は２００±１０ｒｐｍである。フラスコ内での培養終了時、好ましい最終ＯＤ５９０ｎｍは０．６〜１．８であり、好ましいグラム染色では、グラム陽性球菌のみが得られる。プールしたビンにおいて、好ましい培養物純度は、夾雑物がないような純度である。最後に、好ましいインキュベーション時間は３〜５時間である。]
[0061] フィードバッチ式発酵プロセス
本発明は、フィードバッチ式プロセスを用いた製造規模での連鎖球菌属の改善された培養方法を提供する（図６〜１８参照）。フィードバッチ式培養は、固定容量フィードバッチ式または可変容量フィードバッチ式のいずれかであり得る。固定容量フィードバッチ式培養では、限定的基質を、培養物を希釈することなく供給する（例えば、濃縮液もしくはガス状物を使用、または透析の使用による）。可変容量フィードバッチ式培養では、発酵期間において、基質供給量によって容量を変更する。] 図１０ 図１１ 図１２ 図１３ 図１４ 図１５ 図１６ 図１７ 図１８ 図６
[0062] ３００Ｌ容発酵槽内での発酵プロセス中、好ましい条件は以下のとおり：培養温度は３６±１℃に設定、発酵槽内部の過圧はおよそ０．２バールに設定、ｐＨは７．３±０．１に設定し、４Ｍ ＮａＯＨを用いて調整、初期攪拌は５０ｒｐｍに設定、初期空気流は２０Ｌ／分に設定、発酵槽内の起泡剤レベルは、可視的にモニタリングし、必要であれば消泡剤ＰＰＧ２５００を用いて調整、溶存酸素圧（ｔｅｎｓｉｏｎ）（ＤＯＴ）は３０％に設定し、攪拌（５０〜３５０ｒｐｍ）によってカスケード状に調節、空気の空気流（２０〜１００Ｌ／分、および酸素流（０〜１００Ｌ／分）である。]
[0063] 本発明は、指定のＯＤレベルでの２回の酵母抽出物の即時添加後、培養培地への炭素源の線形添加を提供する。試料は、播種後の２時間の発酵のバッチ相中に採取し、ＯＤ５９０ｎｍを測定する。試料を１５分ごとに、ＯＤ５９０ｎｍが３に達するまで採取し、この時点で最初の即時バッチ添加を、１５０ｇ／Ｌの酵母抽出物溶液を用いて開始する。最初の添加のおよそ４５分後、ＯＤ５９０ｎｍを再度測定する。試料を１５分ごとに、ＯＤ５９０ｎｍが５に達するまで採取し、この時点で、第２の即時バッチ添加を、１５０ｇ／Ｌの酵母抽出物溶液を用いて開始する。ＯＤ５９０ｎｍが１０〜１２に達したら、線形添加を開始する。この線形添加時では、試料を１時間ごとに採取し、ＯＤ５９０ｎｍを測定する。線形添加をおよそ３時間持続させ、この時点で、パラメータの自動制御を停止する。攪拌は１００ｒｐｍに、および温度は３０℃に調節する。]
[0064] 培養培地
連鎖球菌属種の増殖の維持に適した任意の型の液状培養培地が使用され得る。好ましい培地としては、複合培地（コロンビア寒天培地（ｂｒｏｔｈ）、ＬＢ、Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ、ＯＣ培地、血液寒天培地またはブレインハートインフュージョンなど）；半規定培地（ＭＣＤＭなど）；連鎖球菌属用の化学的に規定される培地（Ｍ１、ＭＣ、ＦＭＣ（参考文献１１）、またはＣ−４８（参考文献１２）など）；ならびに必要な栄養要求性成分を含む真核生物細胞株の培養のために構成した培地（ＲＰＭＩ、スペント培地、マッコイ培地およびイーグル培地など）が挙げられる。典型的な培養培地には、酵母抽出物、ならびに増殖に不可欠な他の要素、例えば、脂質（リノール酸もしくはオレイン酸などの長鎖脂肪酸）、ステロイド類（コレステロールなど）、プリンおよびピリミジン、ミネラル類、ビタミン類ならびに増殖因子、アミノ酸（Ｌ−および／またはＤ−体）および／または化学元素もしくは無機イオン（Ｆｅ、Ｋ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｃａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐおよび／またはＺｎなど）が含まれる。培地の濃度を増大させることによって、より高いＯＤが得られ得、ｃｐの高容積生産がもたらされ得る。したがって、複合培地は、好ましくは、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含み、ビタミン源が、ビオチンと、任意選択でナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される１種類以上のビタミンとからなる。]
[0065] 化学的に規定される培地は、好ましくは、リン酸源、ミネラル源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含み、ビタミン源が、パントテン酸カルシウムと、ナイアシンアミドと、ビオチン、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される１種類以上のビタミンとからなる。]
[0066] 培養培地には、さらに、１種類以上の抗生物質および消泡剤を含めてもよい。典型的な抗生物質としては、カナマイシン、アンピシリンおよびテトラサイクリンが挙げられる。抗生物質は、抗生物質耐性遺伝子を含む特定の細菌を選択するため、および／またはグラム陽性細菌（例えば、連鎖球菌属）を選択するための選択圧力を加えるために使用され得る。したがって、これは、所望のｃｐを発現している細菌に対する選択圧力を維持するために使用され得る。例えば、抗生物質アズトレオナム（ａｚｔｒｉａｎａｍ）は、グラム陰性に対して有効であるが、グラム陽性細菌に対しては有効でない。消泡剤は当該技術分野で知られており、鉱油、医療用オイル、高配合ポリシロキサングリコールコポリマー、シリコーン化合物およびエマルジョン、オキシアルキル化化合物、鉱油／合成ブレンド、グリコール／エステルブレンドなどが挙げられ得る。]
[0067] また、培養物には、培養を向上させる種々の他の要素、例えば、脂質（リノール酸もしくはオレイン酸などの長鎖脂肪酸など）、ステロイド類（コレステロールなど）、プリンおよびピリミジン、ビタミンならびに増殖因子、アミノ酸（Ｌ−および／またはＤ−体）および／または化学元素もしくは無機イオン（Ｆｅ、Ｋ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｃａ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐおよび／またはＺｎなど）の添加を含めてもよい。]
[0068] 培養培地が、動物から採取された添加物（ウシ血清アルブミンなど）を含む場合、これは、培地および最終的にｃｐへの夾雑を回避するため、感染性海綿状脳症のない供給源から採取されたものであるべきである。]
[0069] 炭素源
使用される炭素源の型は必須事項ではない。好ましくは、主な炭素源は、グルコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトデキストリン、デンプン、イヌリン、グリセロール、植物油（大豆油など）、炭化水素、アルコール（メタノールおよびエタノールなど）、有機酸（酢酸類など）からなる群より選択される。より好ましくは、炭素源は、グルコース、グリセロール、ラクトース、フルクトース、スクロースおよび大豆油から選択される。用語「グルコース」は、グルコースシロップ、すなわち、グルコースオリゴマーを含むグルコース組成物を包含する。炭素源は培養物に、固形物または液状物として添加され得る。好ましくは、炭素源は、細胞に対する浸透圧ストレス（これにより、過剰供給がもたらされることになり得る）が回避されるように制御する。これは、通常、発酵持続期間に必要とされる炭素源すべてを、初期バッチ式培養物に添加しないことにより行なわれる。また、炭素源は、培養制限および色素生成がもたらされ得る枯渇が回避されるように制御する（参考文献１３）。]
[0070] 窒素源
使用される窒素源の型は必須事項ではない。好ましくは、窒素源は、尿素、水酸化アンモニウム、アンモニウム塩（硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなど）、他の硝酸塩、アミノ酸（グルタミン酸類およびリシンなど）、酵母抽出物、酵母自己分解物、酵母窒素塩基、タンパク質水解産物（例えば限定されないが、ペプトン、カゼイン水解産物、例えば、トリプトンおよびカザミノ酸）、大豆ミール、Ｈｙ−Ｓｏｙ、トリプシンによる大豆ブロス、綿実粕、麦芽抽出物、コーンスティープリカーならびに糖蜜から選択される。より好ましくは、窒素源は、水酸化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムおよびリン酸アンモニウムから選択される。最も好ましくは、窒素源は水酸化アンモニウムである。窒素源としての水酸化アンモニウムの使用は、水酸化アンモニウムが、さらにｐＨ調整剤としての機能を果たし得るという利点を有する。]
[0071] 硫酸アンモニウムおよび／またはリン酸アンモニウムを窒素源として使用する場合、微生物が必要とするイオウおよび／またはリンの少なくとも一部が満たされ得る。]
[0072] リン源
上記のように、リンを培養培地に添加してもよい。リンは、塩の形態であり得、特に、リン酸塩（上記のようなリン酸アンモニウムなど）またはポリリン酸塩として添加され得る。ポリリン酸塩が使用される場合、これは、ポリリン酸ナトリウムなどのリン酸ガラスの形態であり得る（参考文献１４）。かかるリン酸ガラスは、その可溶性特性が、混合時に沈殿を生じないで栄養素濃縮培地が調製され得るようなものであるため、有用である。]
[0073] 他の可変量
培養温度は３０〜４５℃（例えば、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４℃に）維持される。好ましくは、該温度は約３６℃である。したがって、一定の培養温度が維持されるのを確保するため、培養物の入った槽を加熱または冷却することが必要であり得る。該温度は、倍加時間（ｔｄ）を制御するために使用され得、したがって、所与の培養プロセスでは、該温度は、異なる相（すなわち、バッチ相、フィードバッチ相および炭素供給相）において異なり得る。]
[0074] 培養物の酸素供給量は制御され得る。酸素は、空気、富化酸素、純酸素またはその任意の組み合わせとして供給され得る。酸素濃度のモニタリング方法は当該技術分野で知られている。酸素は、特定の供給速度で送達してもよく、または培養物の溶存酸素含有量を測定し、一定の溶存酸素含有量を維持することを意図して相応して供給することにより必要時に送達してもよい。]
[0075] また、攪拌または曝気の速度も制御され得る。これにより、栄養素と酸素が、培養物の入ったバイオリアクター全体に行き渡ることが確保される。栄養素溶液と個々の細胞との相対速度は、０．５ｍ／秒前後（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０秒）でもよい。]
[0076] 上記のように、培養物のｐＨは、酸またはアルカリの添加によって制御され得る。ｐＨは、典型的には培養中に低下するため、好ましくはアルカリが添加される。適当なアルカリの例としては、ＮａＯＨおよびＮＨ４ＯＨが挙げられる。]
[0077] このような可変量をすべて、コンピュータ、コンピュータ補助デバイスまたは上記のような制御アルゴリズムによって制御してもよい。このような可変量の変更は、培養物の倍加時間を制御するために使用され得る。]
[0078] 多糖の調製
細菌からの莢膜糖の調製方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、参考文献１５、１６、１７などを参照のこと。ＧＢＳの場合では、以下の方法が使用され得る（参考文献１８も参照のこと）。特に、本発明の莢膜多糖の精製方法が使用され得る。上記のように、このような本発明の方法には、以下の工程の１つ以上が含まれ得る。]
[0079] 出発材料
一般的に、細菌の培養中に培養培地中に放出される莢膜多糖は少量であり、したがって、出発材料は、遠心分離した細菌培養物由来の上清みであり得る。しかしながら、より典型的には、出発材料は、莢膜をもつ細菌自体（または細菌ペプチドグリカンを含有する物質）を、莢膜糖が放出されるように処理することによって調製される。ｃｐは細菌から種々の方法によって、例えば、化学的、物理的または酵素的処理によって放出され得る。したがって、多糖の水性調製物を、最初のタンパク質／核酸沈殿反応の前に処理してもよい。]
[0080] 典型的な化学的処理は塩基抽出であり（参考文献１９）（例えば、水酸化ナトリウムを使用）、これにより、莢膜糖とペプチドグリカン主鎖間のホスホジエステル結合が切断され得る。しかしながら、塩基処理により莢膜糖が脱−Ｎ−アセチル化されるため、後に、再−Ｎ−アセチル化が必要であり得る。]
[0081] 典型的な酵素的処理は、ムタノリジンとβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（参考文献２０）の両方の使用を伴うものである。これらは、細菌ペプチドグリカンに対して作用し、本発明での使用のための莢膜糖を放出させるだけでなく、群特異的炭水化物抗原の放出ももたらす。択一的な酵素的処理は、ＩＩ型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ２）での処理を伴うものである。ＰＤＥ２酵素により、水酸化ナトリウム（上記参照）の場合と同じリン酸基が切断され得、群特異的炭水化物抗原が切断されることなく、莢膜糖が脱−Ｎ−アセチル化されることなく莢膜糖が放出され得、それにより、下流の工程が単純化される。したがって、ＰＤＥ２酵素は、莢膜糖の調製に好ましい選択肢である。]
[0082] 本発明のプロセスに好ましい出発材料は、脱−Ｎ−アセチル化莢膜多糖であり、これは、ＵＳ ６２４８５７０（参考文献１９）に記載の塩基抽出によって得られ得る。別の好ましい出発材料は、連鎖球菌属のＰＤＥ２処理生成物である。かかる材料を、後述する沈殿の前に濃縮（例えば、限外濾過）に供してもよい。]
[0083] 出発材料は、後述するように、夾雑タンパク質および／または核酸のアルコール沈殿に供され得る。]
[0084] アルコール沈殿およびカチオン交換
培養後に得られた連鎖球菌属莢膜糖は、一般的に純粋ではなく、細菌の核酸とタンパク質が夾雑している。このような夾雑物は、逐次、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼおよびプロテアーゼで一晩処理することによって除去され得る。しかしながら、好ましい択一例として、このような夾雑物を酵素的に除去するのではなく、アルコール沈殿が使用され得る。必要であれば（例えば、塩基抽出後）、該物質を、通常、沈殿の前に中和する。]
[0085] 夾雑核酸および／またはタンパク質の沈殿に使用されるアルコールは、好ましくは低級アルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオールなどである。適切なアルコールの選択は、過度な負担なく経験的に試験され得るが、フェノールなどのアルコールよりも、エタノールおよびイソプロパノール（プロパン−２−オール）などのアルコールが好ましい。]
[0086] アルコールは多糖懸濁液に、好ましくは、最終アルコール濃度が１０％〜５０％（例えば、３０％前後）となるように添加される。最も有用な濃度は、多糖が同時に沈殿されることなく夾雑物の充分な沈殿が達成される濃度である。至適最終アルコール濃度は、多糖が得られた細菌血清型に依存し得るが、過度な負担なく常套的な実験によって決定することができる。エタノール濃度＞５０％のとき、多糖の沈殿が観察された。]
[0087] アルコールは、純粋な形態で添加してもよく、混和性の溶媒（例えば、水）で希釈した形態で添加してもよい。好ましい溶媒混合物はエタノール：水混合物であり、好ましい比率は、７０：３０前後および９５：５前後（例えば、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０）である。]
[0088] また、該糖を水性金属カチオンで処理してもよい。一価および二価の金属カチオンが好ましく、錯体形成により効率的であるため、二価カチオン（例えば、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｃａなど）が特に好ましい。カルシウムイオンは特に有用であり、そのため、アルコール混合物は、好ましくは可溶性カルシウムイオンを含むものである。これは、糖／アルコール混合物にカルシウム塩の形態で添加され得、固形または水性形態のいずれかとして添加され得る。カルシウムイオンは、好ましくは、塩化カルシウムの使用によって供給される。]
[0089] カルシウムイオンは、好ましくは、１０〜５００ｍＭ（例えば、約０．１Ｍ）の終濃度で存在させる。至適最終Ｃａ濃度は、連鎖球菌属菌株および多糖が得られた血清型に依存し得るが、過度な負担なく常套的な実験によって決定することができる。]
[0090] 夾雑タンパク質および／または核酸のアルコール沈殿後、莢膜多糖は溶液中に残存する。沈殿物質は多糖から、遠心分離などの任意の適当な手段によって分離され得る。上清みは、後の工程でフィルターを詰まらせ得る粒子（例えば、０．２２μｍより大きい直径を有する沈殿粒子）を除去するために、精密濾過、特にデッドエンド濾過（垂直型濾過）に供され得る。デッドエンド濾過の択一例として、、タンジェンシャル精密濾過が使用され得る。例えば、０．２μｍのセルロース膜を用いたタンジェンシャル精密濾過が使用され得る。タンジェンシャル精密濾過工程の後、典型的には、０．４５／０．２μｍフィルターを用いた濾過が行なわれる。]
[0091] ダイアフィルトレーション
ダイアフィルトレーション工程が使用されてもよい。例えば、該方法が、上記のアルコール沈殿およびカチオン交換を含む場合、この工程は、タンパク質および／または核酸の沈殿後に行なわれ得る。同様に、該方法が、後述するカチオン系デタージェント処理工程を含む場合、このダイアフィルトレーション工程は、デタージェント媒介性沈殿の前に行なわれ得る。付着性フィルターを用いた濾過（例えば、タンパク質付着性フィルターによる濾過）を含む本発明の方法では、このダイアフィルトレーション工程は、該濾過の前に行なわれ得る。典型的には、ダイアフィルトレーション工程は、タンパク質および／または核酸の沈殿の後であって、デタージェント媒介性沈殿または付着性フィルター（例えば、タンパク質付着性フィルター）を用いた濾過の前に使用される。]
[0092] ダイアフィルトレーション工程は、塩基抽出またはホスホジエステラーゼが莢膜糖の放出に使用された場合、群特異的糖もまた加水分解され、元の莢膜糖よりもずっと小さな断片が得られるため、特に好都合である。このような小断片は、ダイアフィルトレーション工程によって取り出され得る。]
[0093] タンジェンシャルフローダイアフィルトレーションが典型的である。したがって、濾過膜は、群特異的抗原の水解産物の通過は可能であるが、莢膜多糖は保持するものであるのがよい。１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの範囲のカットオフが典型的である。群特異的抗原の加水分解断片は、一般的に１ｋＤａ前後（５量体、８量体および１１量体の糖）であるため、小さいカットオフサイズを使用するのがよいが、大きなカットオフは、莢膜糖のロスをもたらすことなく、他の夾雑物の除去を可能にするのに好都合である。]
[0094] 通常、少なくとも５サイクル、例えば、６、７、８、９、１０、１１回以上のタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションが行なわれる。典型的には、２サイクルのタンジェンシャルフローダイアフィルトレーションが行なわれる。最初のサイクルと２回目のサイクルの間に、最初のダイアフィルトレーションサイクルの保持液を、酢酸／酢酸ナトリウム溶液で処理してもよい。得られた懸濁液を、例えば、０．４５μｍフィルターを用いて濾過し、沈殿物を除去してもよい。またこの懸濁液を、あるいはさらに、０．２μｍフィルターを用いて濾過してもよい。]
[0095] ダイアフィルトレーションの後に、０．４５／０．２μｍフィルターを用いたさらなる濾過を行なってもよい。]
[0096] カチオン系デタージェント処理
可溶性多糖を沈殿させるための多くの手法が当該技術分野で知られている。該糖は、任意選択で、１種類以上のカチオン系デタージェントを用いて沈殿させてもよいが、精製の好ましい実施形態では、タージェント沈殿を除外する。莢膜糖と群特異的糖の混合物をカチオン系デタージェントで処理すると、莢膜糖の優先的な沈殿がもたらされ、それにより、群特異的糖による夾雑が好都合かつ簡便に最小化される。]
[0097] 本発明のプロセスにおける使用のための特に好ましいデタージェントは、テトラブチルアンモニア塩およびセチルトリメチルアンモニア塩（例えば、臭化物塩）である。臭化セチルトリメチルアンモニア（ＣＴＡＢ）は特に好ましい（参考文献２１）。ＣＴＡＢはまた、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニア、臭化セトリモニウム、ＣｅｔａｖｌｏｎおよびＣｅｎｔｉｍｉｄｅとしても知られている。他のデタージェントとしては、臭化ヘキサジメトリンおよびミリスチルトリメチルアンモニア塩が挙げられる。]
[0098] デタージェント媒介性沈殿工程は、好ましくは莢膜多糖に対して選択的である。]
[0099] 好都合には、任意選択のデタージェント沈殿は、ＣＴＡＢなどの、糖内のシアル酸残基と例えばシアル酸のカルボキシル基によって相互作用するデタージェントを使用するものであるのがよい。したがって、デタージェントにより、混合集団中のシアル酸含有莢膜糖、特に長鎖の糖が優先的に沈殿され、したがって、抗原として重要なシアル酸が先の処理工程で損傷されているかもしれない糖による夾雑が最小化される。]
[0100] 再可溶化
任意選択のデタージェント沈殿工程が使用される場合、多糖（典型的には、カチオン系デタージェントとの複合体の形態）は、水性媒体またはアルコール系媒体のいずれかに再可溶化され得る。水性再可溶化では、沈殿物中のＣＴＡ−カチオンが、一般的に、金属カチオンで置き換えられ、アルコール系再可溶化では、ＣＴＡ−カチオンは一般的に保持される。水性またはアルコール系の再可溶化の選択は、ＧＢＳ多糖が得られた血清型およびこの段階でなお存在する夾雑物（あれば）に依存し得る。例えば、場合によっては沈殿ペレット中に色素が存在し、これは、アルコール系再可溶化の後、炭素濾過によって有効に除去され得る。]
[0101] 再可溶化のための典型的な水性媒体は金属カチオンを含むものである。一価および二価の金属カチオンが好ましく、二価カチオン（例えば、Ｍｎ、Ｃａなど）が特に好ましい。カルシウムイオンは特に有用であり、そのため、再可溶化は、好ましくは、塩化カルシウムの使用によって供給されるＣａを使用するものである。１０〜５００ｍＭ（例えば、約０．１Ｍ）のＣａ濃度が好ましい。至適最終Ｃａ濃度は、連鎖球菌属多糖が得られた血清型に依存し得るが、過度な負担なく常套的な実験によって決定することができる。]
[0102] 再可溶化のための典型的なアルコール系媒体は、エタノール系のものである。核酸および／またはタンパク質の沈殿に使用されるものと同じアルコールが使用され得るが、莢膜糖の沈殿に必要とされる濃度の方が一般的に高く、例えば、アルコールは、好ましくは、最終アルコール濃度が７０％〜９５％（例えば、およそ７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％）となるように添加される。至適最終アルコール濃度は、連鎖球菌属多糖が得られた血清型に依存し得る。高いアルコール濃度を得るためには、水分含有量の少ないアルコール（例えば、９６％エタノール）を添加することが好ましい。]
[0103] 再可溶化は、典型的には室温で行なう。好ましくは、酸性条件を回避し、再可溶化は、典型的には約ｐＨ７で行なう。]
[0104] 再可溶化された物質は、沈殿前の懸濁液と比べて高度に精製されたものである。]
[0105] 該糖の調製のための好ましい方法の一例は、多糖の沈殿後、上記の低級アルコールを用いた沈殿多糖の可溶化を伴うものである。再可溶化後、夾雑物を除去するために、多糖をさらに処理してもよい。]
[0106] これは、夾雑が微量であっても許容され得ない（例えば、ヒト用ワクチン作製用）状況では、特に重要である。これは、典型的には、１つ以上の濾過工程を伴い、例えば、デプス濾過、活性炭による濾過が使用され得る（サイズ濾過および／または限外濾過）。濾過して夾雑物を除去したら、多糖を、さらなる処理および／または加工処理のために沈殿させ得る。これは、カチオン交換（例えば、カルシウム塩またはナトリウム塩の添加）によって簡便に行なわれ得る。]
[0107] 付着性フィルターを用いた濾過
好ましい実施形態において、莢膜多糖の精製は、さらに、タンパク質および／またはＤＮＡ夾雑物を、タンパク質および／またはＤＮＡは付着するが、莢膜多糖は付着しないか、もしくはわずかに弱く付着するフィルター（例えば、タンパク質付着性フィルター）を用いた濾過によって除去する工程を含む。かかるフィルターの好ましい例は、カーボンフィルターである。好適な付着性フィルターは上記のものである。]
[0108] 付着性フィルターを用いた濾過の後、０．４５／０．２μｍフィルターを用いたさらなる濾過を行なってもよい。]
[0109] 再−Ｎ−アセチル化
再−Ｎ−アセチル化工程は、例えば、付着性フィルターを用いた濾過工程後、または実施する場合は、さらなる濾過工程後に行なわれ得る。再−Ｎ−アセチル化は、ＧＢＳ莢膜糖内のシアル酸残基が、例えば上記の塩基処理中に脱−Ｎ−アセチル化された場合、好都合であり得る。再−Ｎ−アセチル化の制御は、例えば、無水酢酸（ＣＨ３ＣＯ）２Ｏを含む５％重炭酸アンモニウムなどの試薬を用いて簡便に行なわれ得る［Ｗｅｓｓｅｌｓら（１９８９）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５７：１０８９−９４］。]
[0110] さらなるダイアフィルトレーション
さらなるダイアフィルトレーション工程は、例えば、再−Ｎ−アセチル化後に行なわれ得る。ダイアフィルトレーションは、「ダイアフィルトレーション」という標題のセクションにおいて上記のようにして行なわれ得る。]
[0111] ダイアフィルトレーションの後、０．４５／０．２μｍフィルターを用いたさらなる濾過を行なってもよい。]
[0112] 最終物質
多糖は、好ましくは最終的に、コンジュゲーションの準備ができた乾燥粉末として調製される。]
[0113] コンジュゲートの作製
細菌の培養および莢膜多糖の調製後、該糖を担体タンパク質（１つまたは複数）にコンジュゲートさせる。一般に、担体との糖の共有結合性コンジュゲーションにより、糖がＴ非依存性抗原からＴ依存性抗原に変換され、したがって免疫記憶のための初期抗原刺激が可能になるため、糖の免疫原性が増強される。コンジュゲーションは、小児用ワクチンに特に有用であり（例えば、参考文献２２）、よく知られた手法である（例えば、参考文献２３〜３１に概説）。]
[0114] 好ましい担体タンパク質は、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドなどの細菌の毒素またはトキソイドである。ジフテリア毒素のＣＲＭ１９７変異型（参考文献３２〜３４）は、そのままでジフテリアトキソイドであるため、特に好ましい担体である。他の好適な担体タンパク質としては、Ｎ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外側膜タンパク質（参考文献３５）、合成ペプチド（参考文献３６，３７）、熱ショックタンパク質（参考文献３８，３９）、百日咳タンパク質（参考文献４０，４１）、サイトカイン（参考文献４２）、リンホカイン（参考文献４２）、ホルモン類（参考文献４２）、増殖因子（参考文献４２）、種々の病原体由来抗原に由来する多くのヒトＣＤ４ Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（参考文献４３）、例えば、Ｎ１９（参考文献４４）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ（参考文献４５，４６）、肺炎球菌の表面タンパク質ＰｓｐＡ（参考文献４７）、ニューモリシン（参考文献４８）、鉄取り込みタンパク質（参考文献４９）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のトキシンＡまたはＢ（参考文献５０）、ＧＢＳタンパク質（下記参照）（参考文献５１）などが挙げられる。担体との結合は、好ましくは、例えば、担体タンパク質のリシン残基またはアルギニン残基の側鎖内の−ＮＨ２基によるものである。糖が遊離アルデヒド基を有する場合、これは担体内のアミンと反応し、還元的アミノ化によってコンジュゲートを形成し得る。かかるコンジュゲートは、糖内の酸化ガラクトース（アルデヒドが形成される）と、担体またはリンカー内のアミンが関与する還元的アミノ化を用いて作出され得る。また、結合は、例えば、システイン残基の側鎖内の−ＳＨ基によるものであり得る。]
[0115] 例えば、担体抑制のリスクを低減するために、１つより多くの担体タンパク質を使用することが可能である。したがって、異なる担体タンパク質が異なる連鎖球菌属菌株または血清型に対して使用され得、例えば、ＧＢＳ血清Ｉａ型の糖をＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせ得、一方、血清Ｉｂ型の糖は、破傷風トキソイドにコンジュゲートさせ得る。また、１つより多くの担体タンパク質を特定の糖抗原に対して使用することも可能であり、例えば、血清型ＩＩＩの糖を２つの群に分け、一部をＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせ、他の一部を破傷風トキソイドにコンジュゲートさせてもよい。しかしながら、一般には、すべての糖に対して同じ担体タンパク質を使用することが好ましい。]
[0116] 単一の担体タンパク質が１つより多くの糖抗原を有していてもよい（参考文献５２、５３）。例えば、単一の担体タンパク質が血清Ｉａ型およびＩｂ型の糖にコンジュゲートされ得る。この目的を達成するため、コンジュゲーション反応前に、異なる糖が混合され得る。しかしながら、一般には、各血清群が別々のコンジュゲートを有し、異なる糖は、コンジュゲーション後に混合されることが好ましい。該別々のコンジュゲートは、同じ担体のものであってもよい。]
[0117] タンパク質過剰（例えば、１：５）〜糖過剰（例えば、５：１）の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有するコンジュゲートが好ましい。１：２〜５：１の比が好ましい（ｉｒｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）（１：１．２５〜１：２．５の比）。また、１：１〜４：１の比も好ましい。糖鎖が長い場合、糖を重量過剰とするのが典型的である。一般に、本発明は、担体に連結された連鎖球菌属、好ましくはＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの莢膜糖部分を含み、糖：担体の重量比が少なくとも２：１であるコンジュゲートを提供する。]
[0118] 組成物に含まれる遊離担体は少量であるのがよい。所与の担体タンパク質が、本発明の組成物中に遊離形態とコンジュゲート形態の両方で存在する場合、非コンジュゲート形態は、組成物全体において、好ましくは担体タンパク質の総量の５％以下であり、より好ましくは２重量％未満で存在する。]
[0119] 任意の適当なコンジュゲーション反応が、必要な場合は任意の適当なリンカーとともに使用され得る。]
[0120] 糖は、典型的には、コンジュゲーション前に活性化または官能性付与される。活性化は、例えば、ＣＤＡＰ（例えば、１．−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（参考文献５４、５５など））などのシアニル化試薬を伴うものであり得る。他の適当な手法は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、およびＴＳＴＵを使用するものである（参考文献２９の序論も参照のこと）。]
[0121] リンカー基による連結は、任意の既知の手順、例えば、参考文献５６および５７に記載の手順を用いて行なわれ得る。結合の型の一例は、多糖の還元的アミノ化、得られたアミノ基とアジピン酸リンカー基の一端とのカップリング、次いで、タンパク質とアジピン酸リンカー基の他端とのカップリングを伴うものである（参考文献２７、５８、５９）。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド（参考文献６０）、ニトロフェニルエチルアミン（参考文献６１）、ハロゲン化ハロアシル（参考文献６２）、グリコシド結合（参考文献６３）、６−アミノカプロン酸（参考文献６４）、ＡＤＨ（参考文献６５）、Ｃ４〜Ｃ１２部分（参考文献６６）などが挙げられる。リンカーの使用の択一例として、直接結合が使用され得る。タンパク質との直接結合は、多糖の酸化、続いてタンパク質との還元的アミノ化（例えば、参考文献６７および６８に記載）を含み得る。]
[0122] 糖内へのアミノ基の導入（例えば、末端の＝Ｏ基を−ＮＨ２で置き換えることにより）、続いてアジピン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）での誘導体化および担体タンパク質との反応を伴うプロセスが好ましい。別の好ましい反応は、プロテインＤ担体でのＣＤＡＰ活性化を使用するものである。]
[0123] ：コンジュゲーション後、遊離糖とコンジュゲート糖は分離され得る。適当な方法が多数あり、疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外濾過、ダイアフィルトレーションなどが挙げられる（参考文献６９および７０なども参照のこと）。]
[0124] 本発明の組成物が解重合オリゴ糖を含む場合、解重合はコンジュゲーションの前に行なう、例えば、糖の活性化の前であることが好ましい。]
[0125] 好ましいコンジュゲーション法の一例では、糖をアジピン酸ジヒドラジドと反応させる。血清群Ａでは、この段階でカルボジイミドも添加してもよい。反応期間後、ナトリウムシアノボロヒドリドを添加する。次いで、誘導体化された糖が、例えば限外濾過によって調製され得る。]
[0126] 次いで、誘導体化された糖を担体タンパク質（例えば、ジフテリアトキソイド）と混合し、カルボジイミドを添加する。反応期間後、コンジュゲートが回収され得る。]
[0127] 他の工程
上記の工程を含めるとともに、本発明の方法に、さらに、さらなる工程を含めてもよい。例えば、該方法は、莢膜糖を細菌から調製した後であってコンジュゲーションの前に、莢膜糖の解重合工程を含むものであり得る。解重合によって糖の鎖長が短くなり、ＧＢＳには良好でない場合があり得る。連鎖球菌属、特にＧＢＳでは、糖が長鎖であるほど、短鎖のものより免疫原性が大きくなる傾向にある（参考文献７１）。]
[0128] コンジュゲーション後、非コンジュゲート担体タンパク質のレベルが測定され得る。この測定を行なう方法の一例は、キャピラリー電気泳動（参考文献７２）（例えば、遊離溶液中）、またはミセル動電クロマトグラフィー（参考文献７３）を伴うものである。]
[0129] コンジュゲーション後、非コンジュゲート糖のレベルが測定され得る。この測定を行なう方法の一例は、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（参考文献６９）を伴うものである。]
[0130] コンジュゲーション後、コンジュゲート糖を非コンジュゲート糖から分離する工程が使用され得る。これらの糖を分離する方法の一例は、一方の成分を選択的に沈殿させる方法の使用である。例えば、デオキシコール酸塩処理によって非コンジュゲート糖を溶液中に残存させるコンジュゲート糖の選択的沈殿が好ましい（参考文献６９）。]
[0131] コンジュゲーション後、コンジュゲートの分子サイズおよび／またはモル質量を測定する工程が行なわれ得る。特に、分布が測定され得る。このような測定を行なう方法の一例は、サイズ排除クロマトグラフィーとともに多角度光散乱測光法および示差屈折率測定法による検出（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ／ＲＩ）（参考文献７４）を伴うものである。]
[0132] コンジュゲートの組み合わせ
任意の肺炎球菌血清群について、個々のコンジュゲートは上記のようにして調製され得る。]
[0133] 好ましくは、コンジュゲートは、血清群１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆのうちの１種類以上について調製する。次いで、多価混合物を得るために、個々のコンジュゲートを混合してもよい。]
[0134] また、選択した数のコンジュゲートを混合し、２価、３価、４価、５価、６価、７価または１１価の混合物を得ることも可能である（例えば、１＋３＋４＋５＋６Ｂ＋７Ｆ＋９Ｖ＋１４＋１８Ｃ＋１９Ｆ＋２３Ｆ、４＋６Ｂ＋９Ｖ＋１４＋１８Ｃ＋１９Ｆ＋２３Ｆまたは１＋４＋６Ｂ＋９Ｖ＋１４＋１８Ｃ＋１９Ｆ＋２３Ｆを混合など）。]
[0135] ＧＢＳでは、コンジュゲートは、好ましくは血清群Ｉａ、ＩｂまたはＩＩＩのうちの１種類以上から調製する。]
[0136] コンジュゲートは、これらを個々に緩衝溶液に添加することにより混合され得る。好ましい溶液はリン酸緩衝生理食塩水（終濃度１０ｍＭのリン酸ナトリウム）である。最終混合物中の各コンジュゲートの好ましい濃度（糖として測定）は１〜２０μｇ／ｍｌ、例えば５〜１５μｇ／ｍｌ（８μｇ／ｍｌ前後など）である。任意選択のアルミニウム塩アジュバントは、この段階で添加され得る（例えば、最終Ａｌ３＋濃度を０．４〜０．５ｍｇ／ｍｌにするため）。]
[0137] 混合後、混合したコンジュゲートは滅菌濾過され得る。]
[0138] 医薬組成物
本発明の方法によって調製されたコンジュゲートを、薬学的に許容され得る担体と合わせてもよい。かかる担体としては、それ自体は、該組成物を受ける個体に対して有害な抗体生成を誘導しない任意の担体が挙げられる。好適な担体は、典型的には、大型のゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、スクロース、トレハロース、ラクトース、および脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）などである。かかる担体は当業者には充分わかる。また、ワクチンには、例えば、水、生理食塩水、グリセロールなどの希釈剤を含めてもよい。また、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質を存在させてもよい。滅菌されたパイロジェンフリーのリン酸緩衝生理食塩水は典型的な担体である。薬学的に許容され得る賦形剤の詳細な論考は参考文献７５において入手可能である。]
[0139] 該組成物には、特に、反復用量形式でパッケージングされる場合、抗菌剤が含まれ得る。]
[0140] 該組成物に、デタージェント、例えばＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）（ＴＷＥＥＮ ８０（ＴＭ）など）を含めてもよい。デタージェントは、一般的には低レベル（例えば、＞０．０１％）で存在する。]
[0141] 該組成物に、張度を付与するためのナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含めてもよい。１０±２ｍｇ／ｍｌの濃度のＮａＣｌが典型的である。]
[0142] 該組成物は、一般的にバッファーを含む。リン酸バッファーが典型的である。]
[0143] 該組成物には、特に、凍結乾燥される場合、または凍結乾燥物質から再構成された物質を含む場合、糖アルコール（例えば、マンニトール）または二糖（例えば、スクロースもしくはトレハロース）が、例えばおよそ１５〜３０ｍｇ／ｍｌ（例えば、２５ｍｇ／ｍｌ）で含まれ得る。凍結乾燥用組成物のｐＨは、凍結乾燥前に６．１前後に調整され得る。]
[0144] コンジュゲートは、他の免疫調節剤とともに投与され得る。特に、該組成物は、通常、ワクチンアジュバントを含む。本発明の組成物に使用され得るアジュバントとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる。]
[0145] Ａ．ミネラル含有組成物
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したミネラル含有組成物組成物としては、アルミニウム塩およびカルシウム塩（またはその混合物）などのミネラル塩が挙げられる。本発明は、ミネラル塩、例えば、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩など（例えば、参考文献７６の第８章および第９章参照）、または異なるミネラル化合物の混合物を含み、該化合物には、任意の適当な形態（例えば、ゲル、結晶性、アモルファスなど）が採用され、吸着が好ましい。また、ミネラル含有組成物を金属塩の粒子として構築してもよい（参考文献７７）。]
[0146] リン酸アルミニウムは、特に、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ糖抗原を含む組成物において特に好ましく、典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２のＰＯ４／Ａ１モル比を有するアモルファスヒドロキシリン酸アルミニウムである（０．６ｍｇ Ａｌ＋３／ｍｌで含む）。]
[0147] 低用量のリン酸アルミニウムとの吸着、例えば、５０〜１００μｇのＡｌ３＋／コンジュゲート／用量が使用され得る。１つより多くのコンジュゲートが組成物中に存在する場合、すべてのコンジュゲートを吸着させる必要はない。]
[0148] カルシウム塩としては、リン酸カルシウム（例えば、参考文献２５８に開示された「ＣＡＰ」粒子が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられ、該塩には任意の適当な形態（例えば、ゲル、結晶性、アモルファスなど）が採用される。このような塩への吸着が好ましい。また、ミネラル含有組成物を金属塩の粒子として構築してもよい［７７］。アルミニウム塩アジュバントは、より詳細に後述する。]
[0149] 水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして知られているアジュバントが使用され得る。これらの名称は慣用的であるが、便宜上使用されているものであって、いずれも、存在する実際の化合物の正確な記載ではない（例えば、参考文献７６の第９章参照）。本発明では、一般にアジュバントとして使用されている任意の「水酸化物」または「リン酸塩」アジュバントが使用され得る。]
[0150] 「水酸化アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは、通常、少なくとも一部分が結晶性である。オキシ水酸化アルミニウムは、式ＡｌＯ（ＯＨ）で表されるものであり得、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３などの他のアルミニウム化合物とは、赤外（ＩＲ）分光法によって、特に、１０７０ｃｍ−１における吸着バンドおよび３０９０〜３１００ｃｍ−１における大きな肩部の存在によって識別され得る［参考文献７６の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、半値幅（ＷＨＨ）における回折バンド幅によって反映され、結晶性が不充分な粒子は、微結晶サイズが小さいため、大きく広がったラインを示す。表面積は、ＷＨＨが増大するにつれて増大し、アジュバントは、大きなＷＨＨ値を有するほど大きな抗原吸着能を有することが観察された。繊維状の形態構造（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られる）は、水酸化アルミニウムアジュバントに典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは典型的には約１１である、すなわち、アジュバント自体は、生理学的ｐＨにおいて正の表面電荷を有する。水酸化アルミニウムアジュバントについて、ｐＨ７．４で１．８〜２．６ｍｇタンパク質／ｍｇ Ａｌ＋＋＋の吸着能が報告されている。]
[0151] 「リン酸アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的にはヒドロキシリン酸アルミニウムであり、これは、多くの場合、少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩）も含有している。これは、沈殿によって得られ得、沈殿時の反応条件と濃度は、塩内でヒドロキシルがリン酸基に置換される程度に影響する。ヒドロキシリン酸塩は、一般的に、０．３〜１．２のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は厳密なＡｌＰＯ４とは、ヒドロキシル基の存在によって識別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃まで加熱した場合）は、ヒドロキシル構造の存在を示す［参考文献７６の第９章］。]
[0152] リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般的に、０．３〜１．２、好ましくは０．８〜１．２、より好ましくは０．９５＋０．１である。リン酸アルミニウムは、一般的に、特にヒドロキシリン酸塩の場合、アモルファスである。典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２のＰＯ４／Ａｌモル比を有するアモルファスヒドロキシリン酸アルミニウムである（０．６ｍｇ Ａｌ３＋／ｍｌで含む）。リン酸アルミニウムは、一般的に微粒状である（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られるようなプレート様形態構造）。粒子の典型的な直径は、任意の抗原吸着後、０．５〜２０μｍ（例えば、約５〜１０μｍ）の範囲である。リン酸アルミニウムアジュバントについて、ｐＨ７．４で０．７〜１．５ｍｇタンパク質／ｍｇ Ａｌ＋＋＋の吸着能が報告されている。]
[0153] リン酸アルミニウムの荷電ゼロ点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルとのリン酸基の置換の程度に反比例し、この置換の程度は、沈殿による塩の調製に使用される反応条件および反応体の濃度に応じて異なり得る。また、ＰＺＣも、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変化させること（より多くのリン酸イオン＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジンバッファーなどのバッファーを添加すること（ＰＺＣがより塩基性となる）により変更される。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般的に、４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５、例えば約５．７のＰＺＣを有する。]
[0154] 本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁液に、バッファー（例えば、リン酸またはヒスチジンまたはＴｒｉｓバッファー）を含めてもよいが、これは必ずしも必要ではない。該懸濁液は、好ましくは滅菌されており、パイロジェンフリーである。該懸濁液は、例えば１．０〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する遊離の水性リン酸イオンを含むものであり得る。また、該懸濁液は塩化ナトリウムを含むものであってもよい。]
[0155] 本発明では、ＤＡＲＯＮＲ１ＸＴＭのような、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物が使用され得る。この場合、リン酸アルミニウムは水酸化物よりも多い方がよく、例えば、重量比は少なくとも２：１、例えば、＞５：１、＞６：１、＞７：１、＞８：１、＞９：１などである。]
[0156] 患者への投与のための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、＜５ｍｇ／ｍｌ、＜４ｍｇ／ｍｌ、＜３ｍｇ／ｍｌ、＜２ｍｇ／ｍｌ、＜１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は０．３〜ｌｍｇ／ｍｌである。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。]
[0157] Ｂ．油性乳剤
本発明におけるアジュバントとしての使用に適した油性乳剤組成物としては、スクアレン−水乳剤、例えば、ＭＦ５９（参考文献７６の第１０章参照；参考文献７８も参照のこと）（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５、マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に構築）が挙げられる。また、完全アジュバントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全アジュバントアジュバント（ＩＦＡ）も使用され得る。]
[0158] 乳剤中の油滴は、一般的に５μｍ未満の直径であり、サブミクロン直径を有する場合でさえあり得、このような小径はマイクロフルイダイザーを用いて達成され、安定な乳剤が得られる。２２０ｎｍ未満の径を有する液滴は、濾過滅菌に供することができるため好ましい。]
[0159] Ｃ．サポニン製剤（参考文献７６の第２２章参照）
サポニン製剤もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花にも見られるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ樹木の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。また、サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ）から商業的に入手することもできる。サポニンアジュバント製剤としては、ＱＳ２１などの精製製剤、ならびにＩＳＣＯＭなどの脂質製剤が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（ＴＭ）として市販されている。]
[0160] サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されたものである。このような手法が使用された具体的な精製画分が同定されており、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の作製方法は、参考文献７９に開示されている。サポニン製剤には、ステロール（コレステロールなど）が含まれることがあり得る（参考文献８０）。]
[0161] サポニンとコレステロールの組み合わせは、免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭ）と称される特殊な粒子を形成するために使用され得る（参考文献７６の第２３章参照）。また、ＩＳＣＯＭは、典型的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどなどのリン脂質を含む。任意の既知のサポニンがＩＳＣＯＭに使用され得る。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１種類以上を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献８０〜８２にさらに説明されている。任意選択で、ＩＳＣＯＭＳは、さらなるデタージェントを含まないものであり得る（参考文献８３）。]
[0162] サポニン系アジュバントの開発の概説は、参考文献８４および８５を見るとよい。]
[0163] Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。このような構造体は、一般的に、任意選択でリン脂質と会合または構築されたウイルス由来の１種類以上のタンパク質を含む。これらは、一般的に、非病原性であり、非複製性であり、一般的に天然ウイルスゲノムを全く含まない。ウイルスタンパク質は、組換えにより作製されたものであってもよく、完全体ウイルスから単離されたものであってもよい。ビロソームまたはＶＬＰにおける使用に適したこのようなウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアまたはキャプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（外被タンパク質など）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１など）に由来するタンパク質が挙げられる。ＶＬＰは、参考文献８６〜９１にさらに論考されている。ビロソームは、例えば参考文献９２にさらに論考されている。]
[0164] Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体
本発明における使用に適したアジュバントは、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドならびにＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体などを包含する。]
[0165] ＬＰＳの非毒性誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと４、５または６アシル化鎖との混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小粒子」形態は、参考文献９３に開示されている。かかる３ｄＭＰＬの「小粒子」は、０．２２μｍ膜で滅菌濾過されるのに充分小さい（参考文献９３）。他の非毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物、例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９）（参考文献９４，９５）などが挙げられる。]
[0166] リピドＡ誘導体としては、ＯＭ−１７４などの大腸菌由来のリピドＡの誘導体が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば参考文献９６および９７に記載されている。]
[0167] 本発明におけるアジュバントとしての使用に適した免疫賦活性オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列（グアノシンにリン酸結合によって連結された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドもまた、免疫賦活性であることが示されている。]
[0168] ＣｐＧは、ヌクレオチド修飾／類似体（ホスホロチオエート修飾など）を含むものであってもよく、二本鎖であっても単鎖であってもよい。参考文献９８、９９および１００には、可能な類似置換（例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでのグアノシンの置き換え）が開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１０１〜１０６にさらに論考されている。]
[0169] ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９に対するものであり得る（モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなど）（参考文献１０７）。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であってもよく（ＣｐＧ−ＡＯＤＮなど）、Ｂ細胞応答に対してより特異的であってもよい（ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮなど（ｓｕｃｈ ａ））。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献１０８〜１１０に論考されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。]
[0170] 好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体の認識に利用可能となるように構築される。任意選択で、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をその３’末端で結合させ「イムノマー」を形成してもよい。例えば、参考文献１０７および１１１〜１１３を参照のこと。]
[0171] 細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体は、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。好ましくは、そのタンパク質は、大腸菌（大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（ＰＴ」）に由来するものである。粘膜経由アジュバントとしての無毒化ＡＤＰ−リボシル化毒素の使用は、参考文献１１４に記載されており、非経口アジュバントとしての使用は、参考文献１１５に記載されている。毒素またはトキソイドは、好ましくは、ＡとＢの両方のサブユニットを含むホロトキシンの形態である。好ましくは、Ａサブユニットは無毒化変異を含む；好ましくは、Ｂサブユニットは変異されていない。好ましくは、アジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２などの無毒化ＬＴ変異型である。アジュバントとしてのＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の使用は、参考文献１１６〜１２３を見るとよい。アミノ酸置換の数の参照は、好ましくは、参考文献１２４（引用によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる）に示されたＡＤＰ−リボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアラインメントに基づいて行なう。]
[0172] Ｆ．ヒト免疫調節因子
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したヒト免疫調節因子としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（参考文献１２５）など）（参考文献１２６）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などが挙げられる。好ましい免疫調節因子はＩＬ−１２である。]
[0173] Ｇ．生体接着剤および粘膜接着剤
生体接着剤および粘膜接着剤もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。好適な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア（参考文献１２７）または粘膜接着剤、例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体が挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る（参考文献１２８）。]
[0174] Ｈ．ミクロ粒子
ミクロ粒子もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。生分解性であり非毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物（ａｒｔｈｙｄｒｉｄｅ）、ポリカプロラクトンなど）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）で形成されたミクロ粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの直径、より好ましくは約２００ｎｍ〜約３３μｍの直径、最も好ましくは約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子）が好ましく、任意選択で処理され、負電荷を有する表面（例えば、ＳＤＳで）または正電荷を有する表面（例えば、カチオン系デタージェント（ＣＴＡＢなど）で）を有する。]
[0175] Ｉ．リポソーム（参考文献７６の第１３章および第１４章）
アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、参考文献１２９〜１３１に記載されている。]
[0176] Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル製剤
本発明における使用に適したアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル（参考文献１３２）を包含する。かかる製剤は、さらに、オクトキシノールと組み合わされたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（参考文献１３３）、ならびに少なくとも１種類のさらなる非イオン系界面活性剤（オクトキシノールなど）と組み合わされたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤（参考文献１３４）を包含する。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルから選択される。]
[0177] Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ製剤は、例えば、参考文献１３５および１３６に記載されている。]
[0178] Ｌ．ムラミルペプチド
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。]
[0179] Ｍ．イミダゾキノロン化合物
本発明におけるアジュバントとして使用するのに適したイミダゾキノロン化合物の例としては、イミキモド（ＴＭ）およびその相同物（例えば、レシキモド３Ｍ（ＴＭ））が挙げられ、参考文献１３７および１３８にさらに記載されている。]
[0180] また、本発明は、上記において特定したアジュバントの１つ以上の態様の組み合わせを含む。例えば、以下：（１）サポニンと水中油型乳剤（参考文献１３９）；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（参考文献１４０）；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２Ｉ）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（任意選択で＋ステロール）（参考文献１４１）；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型乳剤（参考文献１４２）との組み合わせ；（６）ＳＡＦ、１０％スクアラン、０．４％ＴＷＥＥＮ８０（ＴＭ）、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ含有（サブミクロン乳剤にマイクロフルイダイズしたもの、またはボルテックスして大粒系乳剤にしたもののいずれか）、（７）ＲＩＢＩ（ＴＭ）アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、２％スクアレン、０．２ ＴＷＥＥＮ８０（ＴＭ）と、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ジミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群の１種類以上の細菌細胞壁成分含有；好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（ＴＭ））；ならびに（８）１種類以上のミネラル塩（アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（３ｄＭＰＬなど）のアジュバント組成物が本発明において使用され得る。]
[0181] 免疫賦活剤として作用する他の物質は、参考文献７６の第７章に開示されている。]
[0182] 水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用が特に好ましく、一般的には、抗原をこのような塩に吸着させる。リン酸カルシウムは別の好ましいアジュバントである。]
[0183] 該組成物は、滅菌および／またはパイロジェンフリーであるのがよい。組成物は、ヒトに関して等張性であるのがよい。]
[0184] 組成物は、バイアルにて提示してもよく、充填済みシリンジにて提示してもよい。シリンジは、針を取り付けたものであっても、そうでなくてもよい。シリンジは単回用量の組成物を含むものであるが、バイアルは単回用量を含むものであっても反復用量を含むものであってもよい。注射用組成物は、通常、液状の溶液または懸濁液である。あるいはまた、該組成物を、注射前に液状ビヒクルで液剤または懸濁剤にするための固体形態（例えば、凍結乾燥型）で提示してもよい。]
[0185] 組成物は、単位用量形態または反復用量形態でパッケージングされ得る。反復用量形態には、バイアルが充填済みシリンジよりも好ましい。有効投薬容量は、常套的に確立され得るが、注射用組成物の典型的なヒト用量は０．５ｍｌの容量を有する。]
[0186] 組成物が使用前に即時調製されるものであり（例えば、成分が凍結乾燥形態で提示される）、キットとして提示される場合、キットは、２つのバイアルを含むものであってもよく、１つの充填済みシリンジと１つのバイアルを含み、シリンジの内容物は、バイアルの内容物を注射前に再活性化させるために使用されるものであってもよい。]
[0187] ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原（１種類または複数種）、ならびに必要に応じて任意の他の成分を含む。免疫学的有効量により、単回用量または一連の用量の一部のいずれかでの該量の個体への投与が、処置または予防に有効であるを意図する。この量は、処置対象の個体の健康状態および体調、処置対象の個体の年齢、分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫機構が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、ワクチンの配合、処置担当医による病状の評価、ならびに他の関連要素に応じて異なる。この量は、常套的な治験によって決定され得る比較的広い範囲になることが予測され、各連鎖球菌コンジュゲートの典型的な量は、１μｇ〜２０μｇ／コンジュゲート（糖として測定）である（ｉｎ ｂｅｔｗｅｅｎ）。]
[0188] したがって、本発明は、（ａ）上記のようなコンジュゲートを調製する工程；（ｂ）該コンジュゲートを１種類以上の薬学的に許容され得る担体と混合する工程を含む、医薬組成物の調製方法を提供する。]
[0189] さらに、本発明は、（ａ）上記のようなコンジュゲートを調製する工程；（ｂ）該コンジュゲートと１種類以上の薬学的に許容され得る担体と混合する工程；および（ｃ）コンジュゲート／担体混合物を、バイアルまたはシリンジなどの容器内にパッケージングして医薬製剤を得る工程を含む、医薬製剤の調製方法を提供する。シリンジ内への挿入は、工場または外科処置にて行なわれ得る。]
[0190] また、本発明は、コンジュゲートを薬学的に許容され得る担体と混合する工程を含み、該コンジュゲートが上記のようなコンジュゲーション法のプロセスによって調製されたものである、糖−タンパク質コンジュゲートからの医薬組成物の調製方法を提供する。該コンジュゲーション法および混合工程は、大きく異なる時点で異なる人々によって異なる場所（例えば、異なる国）で行なわれてもよい。]
[0191] また、本発明は、糖−タンパク質コンジュゲートを医薬製剤にパッケージングするための方法であって、該コンジュゲートが上記のようなコンジュゲーション法のプロセスによって調製されたものであるを提供する。該コンジュゲーション法およびパッケージング工程は、大きく異なる時点で異なる人々によって異なる場所（例えば、異なる国）で行なわれてもよい。]
[0192] 医薬用途
また、本発明は、該組成物を患者に投与することを含む、患者の処置方法を提供する。患者は、疾患のリスクがある患者自体であってもよく、妊娠女性（先天性免疫処置）であってもよい。患者は好ましくはヒトである。ヒトは、任意の年齢、例えば、＜２歳、２〜１１歳、１１〜５５歳、＞５５歳などであり得る。]
[0193] また、本発明は、治療における使用のための組成物を提供する。また、本発明は、疾患の処置のための医薬の製造における該組成物の使用を提供する。好ましくは、疾患はインフルエンザまたは肺炎である。]
[0194] 組成物は、一般的に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射（例えば、経皮、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、もしくは組織の間隙空間に）、または直腸内、経口、膣内、眼経由（ｏｐｔｉｃａｌ）、経皮、皮内、経眼、経鼻、耳内もしくは他の粘膜投与によって行なわれ得る。筋肉内投与（例えば、大腿または上腕への）が好ましい。注射は針（例えば、皮下注射針）によるものであり得るが、無針注射も択一的に使用され得る。典型的な筋肉内用量は０．５ｍｌである。]
[0195] 本発明は、全身性および／または粘膜免疫を誘起するために使用され得る。]
[0196] 投薬処置は、単回用量スケジュールであってもよく、反復用量スケジュールであってもよい。反復用量は、初回刺激免疫処置スケジュールおよび／または追加刺激免疫処置スケジュールにおいて使用され得る。初回刺激用量スケジュールの後に、追加刺激用量スケジュールが行なわれ得る。初回刺激用量間（例えば、４〜１６週間）、および初回刺激と追加刺激間の好適なタイミングは、常套的に決定され得る。]
[0197] 細菌感染は、身体の種々の領域を侵すため、該組成物は種々の形態で調製され得る。例えば、該組成物は注射用剤として、液状の液剤または懸濁剤のいずれかとして調製され得る。また、液状ビヒクル中の液剤または懸濁剤に適した注射前の固形形態を調製してもよい（例えば、凍結乾燥組成物）。該組成物は、経表面投与のためには、例えば、軟膏、クリーム剤または粉末剤として調製され得る。該組成物は、経口投与のためには、例えば、錠剤もしくはカプセル剤として、またはシロップ剤（任意選択でフレーバーを添加）として調製され得る。該組成物は、肺内投与のためには、例えば、微粉末またはスプレーを用いて吸入剤として調製され得る。該組成物は、坐剤または膣坐薬として調製され得る。]
[0198] 該組成物は、経鼻、経耳または経眼投与のためには、例えば、スプレー剤、滴剤、ゲル剤または粉末剤として調製され得る（例えば、参考文献１４３および１４４）。注射用組成物が好ましい。]
[0199] 本発明の組成物のさらなる抗原性成分
本発明の方法はまた、連鎖球菌コンジュゲートを１種類以上の以下の他の抗原：
− Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ由来糖抗原（例えば、参考文献１４５の第１４章）
− Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ精製由来タンパク質抗原
− Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ由来の外膜調製物
−Ａ型肝炎ウイルス由来抗原、例えば、不活化ウイルス（例えば、４６、１４７）
−Ｂ型肝炎ウイルス由来抗原、例えば、表面および／またはコア抗原（例えば、１４７、１４８）
−ジフテリア抗原、例えば、ジフテリアトキソイド（例えば、参考文献１４５の第１３章）
−破傷風抗原、例えば、破傷風トキソイド（例えば、参考文献１４５の第２７章）
− Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来抗原、例えば、百日咳ホロトキシン（ＰＴ）およびＢ． ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）（任意選択で、ペルタクチンおよび／または凝集原２や３との組み合わせも）（例えば、参考文献１４９および１５０；参考文献１４５の第２１章）
−ポリオ抗原（１種類または複数種）（例えば、１５１、１５２）例えば、ＩＰＶ（参考文献１４５の第２４章）
−麻疹、流行性耳下腺炎および／または風疹抗原（例えば、参考文献１４５の第１９、２０および２６章）
−インフルエンザ抗原（１種類または複数種）（例えば、参考文献１４５の第１７章）、例えば、血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質
− Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来抗原（例えば、１５３）
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌属）由来タンパク質抗原（例えば、１５４、１５５）
− Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌属）由来抗原（例えば、１５５、１５６、１５７）
− Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来抗原（例えば、１５８）
と混合する工程を含むものであり得る。]
[0200] 該組成物は、このようなさらなる抗原を１種類以上含むものであってもよい。]
[0201] 毒性タンパク質抗原は、必要な場合は無毒化され得る（例えば、化学的および／または遺伝学的手段による百日咳毒素の無毒化（参考文献１５０））。]
[0202] ジフテリア抗原を組成物に含める場合、破傷風抗原と百日咳抗原もまた含めることが好ましい。同様に、破傷風抗原を含める場合、ジフテリアと百日咳の抗原も含めることが好ましい。同様に、百日咳抗原を含める場合、ジフテリアと破傷風の抗原も含める（ｉｎｃｌｕｄ６）ことが好ましい。したがって、ＤＴＰの組み合わせが好ましい。]
[0203] 組成物中の抗原は、典型的には、各々、少なくとも１ｇ／ｍｌの濃度で存在させる。一般に、任意の所与の抗原の濃度は、該抗原に対する免疫応答が誘起されるのに充分な濃度である。]
[0204] 本発明の免疫原性組成物にタンパク質抗原を使用する択一例として、該抗原をコードする核酸（好ましくはＤＮＡ、例えば、プラスミドの形態）が使用され得る。]
[0205] 抗原は、好ましくはアルミニウム塩に吸着させる。]
[0206] 該組成物中に含めるための好ましい非連鎖球菌抗原は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型（Ｈｉｂ）を防御するものである；典型的には、これはＨｉｂ莢膜糖抗原である。Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ由来糖抗原がよく知られている。]
[0207] 好都合には、特に小児において免疫原性を高めるため、Ｈｉｂ糖を担体タンパク質に共有結合によりコンジュゲートさせる。一般には、多糖コンジュゲート、特にＨｉｂ莢膜多糖の調製に関して、充分に文献がある。]
[0208] 本発明では、任意の適当なＨｉｂコンジュゲートが使用され得る。好適な担体タンパク質は上記に記載しており、Ｒｉｂ糖に好ましい担体はＣＲＭ１９７（ＨｂＯＣ）、破傷風トキソイド（ＰＲＰ−Ｔ）およびＮ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜複合体（ＰＲＰ−ＯＭＰ）である。]
[0209] コンジュゲートの糖部分は多糖（例えば、完全長ポリリボシルリビトールリン酸（ＰＲＰ））であり得るが、多糖を加水分解してオリゴ糖（例えば、分子量約１〜約５ｋＤａ）を形成することが好ましい。]
[0210] 好ましいコンジュゲートは、アジピン酸リンカーによってＣＲＭ１９７に共有結合によって連結されたＨｉｂオリゴ糖を含むものである（参考文献１５９、１６０）。破傷風トキソイドもまた好ましい担体である。]
[0211] Ｈｉｂ抗原の投与により、好ましくは＞０．１５μｇ／ｍｌ、より好ましくは１μｇ／ｍｌの抗ＰＲＰ抗体濃度がもたらされる。]
[0212] 該組成物がＨｉｂ糖抗原を含む場合、ともに水酸化アルミニウムアジュバントを含まないことが好ましい。組成物がリン酸アルミニウムアジュバントを含む場合、Ｈｉｂ抗原は、アジュバントに吸着させてもよく（参考文献１６１）、非吸着型であってもよい（参考文献１６２）。吸着の抑制は、抗原／アジュバントの混合時の正しいｐＨ、適切な荷電ゼロ点を有するアジュバント、および組成物中の種々の異なる抗原の適切な混合順序（参考文献１６３）を選択することによりなされ得る。]
[0213] 本発明の組成物は、１種類より多くのＨｉｂ抗原を含むものであってもよい。Ｈｉｂ抗原は、例えば、髄膜炎菌組成物での再構成のための凍結乾燥されたものであってもよい。したがって、Ｈｉｂ抗原は、髄膜炎菌コンジュゲートとは別にパッケージングしてもよく、ともに混合してもよい。]
[0214] 本発明の組成物に含めるための他の非連鎖球菌抗原は、性感染病（ＳＴＤ）由来のものである。かかる抗原により、クラミジア感染、陰部疱疹、肝炎（ＨＣＶなど）、陰部疣贅、淋病（ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、梅毒および／または軟性下疳などのＳＴＤの予防または治療が提供され得る（参考文献１６４）。抗原は、１種類以上のウイルス性または細菌性ＳＴＤに由来するものであってもよい。本発明における使用のためのウイルス性ＳＴＤ抗原は、例えば、ＨＩＶ、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ−１やＨＳＶ−２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、および／または肝炎（ＨＣＶ）に由来するものであり得る。本発明における使用のための細菌性ＳＴＤ抗原は、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉまたは大腸菌に由来するものであり得る。]
[0215] 本発明の実施には、特に記載のない限り、当該技術分野の技能の範囲内である分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用的な手法が使用される。かかる手法は、文献に充分説明されている。例えば、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＭＴＧａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ ＳＴ Ｈｉｇｇｉｎｓ編１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ ＳＴ Ｈｉｇｇｉｎｓ編１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），特に、第１５４巻および第１５５巻；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ． Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ． Ｃａｌｏｓ編１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ編（１９８７），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ． Ｙ．），Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ． ＷｅｉｒおよびＣ． Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編１９８６），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，第１９版（１９９５）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ． ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ． Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ． ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．編，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９９７）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ，（Ｒｅａｍら編，１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ），第２版（Ｎｅｗｔｏｎ ＆ Ｇｒａｈａｍ編，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）；ならびにＰｅｔｅｒｓおよびＤａｌｒｙｍｐｌｅ，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第２版），Ｆｉｅｌｄｓら（編），Ｂ．Ｎ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと。]
[0216] 本明細書では、ヌクレオチドおよびアミノ酸の標準的な略号を使用する。]
[0217] 本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。]
[0218] 実施例
本明細書における方法を例示するため、ＧＢＳ疾患を有する患者から単離したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ０９０、Ｈ３６ｂ、Ｍ７８１、およびＣＢＪ１１１（これらから、４つの代表的な血清型（Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩ、およびＶ）が得られる）を試験した。]
[0219] 実施例１−５リットルおよび２０リットルでの発酵
Ａ）播種材料調製プロセスの開発
３種類のＧＢＳ血清型の培養試験を、１０００ｍＬの播種材料培養物：８ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４二水和物（Ｍｅｒｃｋ）、２ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４一水和物（Ｍｅｒｃｋ）、１７ｇ／Ｌの自己分解型酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１ｍｇ／Ｌのビオチン（Ｍｅｒｃｋ）および３３ｇ／ＬのＤ−グルコース一水和物（Ｍｅｒｃｋ）を入れた５０００ｍＬ容のバッフルなしの振盪フラスコにおいて行なった。化合物はすべて逆浸透水（ＲＯＷ）に溶解させ、０．２２μｍ孔径膜フィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）に通す濾過によって滅菌し、次いで、オートクレーブ内で１２２℃で３０分間滅菌した５０００ｍＬ容三角フラスコに無菌的に添加した。]
[0220] 一連の振盪実験の各々について、培地（ｐＨ＝７．３）に、異なる容量の解凍培養物（作業種菌株は、１０％グリセロール中に−７０℃で保存した）を播種し、水平型振盪器の小室（Ｉｎｎｏｖａ ４３３０、偏心式 １インチ）内で、２００ｒｐｍで攪拌しながら３５℃でインキュベートした。]
[0221] 培養中の種々の時点で、５９０ｎｍにおける光学密度を測定し（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ｎｏｖａｓｐｅｃＩＩ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、また、光学密度値が０．５以上になったとき、ｐＨ値もモニターした（ｐＨメーターＭｅｔｒｏｈｍ）。対数期の期間中の倍加時間を、増殖曲線の線形部分の回帰解析によって求めた。直線の傾きは、最大比増殖速度μｍａｘ、および式ｔｄ＝ｌｎ２／μによる倍加時間（ｔｄ）に相当する。]
[0222] Ｂ）５リットルおよび２０リットル容発酵槽の準備
槽を満たし、培養培地を滅菌する前、発酵槽の計器（ｐＨ電極およびｐＯ２メーター）を、標準的な方法を用いて較正した。]
[0223] ＧＢＳは栄養要求性生物であるため、その増殖に必要とされる特定の有機化合物（アミノ酸やビタミンなど）を合成する能力をもたない。このため、ＷＯ０７／０５２１６８に記載のような、動物起源の成分を含まない低コスト複合培地が開発された。]
[0224] 多糖の生産に使用した基本培地は、２ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４二水和物（Ｍｅｒｃｋ）、１６．７ｇ／Ｌの自己分解型酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３２ｇ／ＬのＤ−グルコース一水和物（Ｍｅｒｃｋ）、１ｍｇ／Ｌのビオチン（Ｍｅｒｃｋ）、０．５ｍｇ／Ｌの塩酸チアミン（ＢＤＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、０．５ｍｇ／Ｌのリボフラビン（Ｆｌｕｋａ）、０．５ｍｇ／Ｌのニコチン酸（Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ）０．５ｍｇ／Ｌの塩酸ピリドキシン（Ｓｉｇｍａ）および起泡の形成を抑制するための１ｍＬ．Ｌ−１ポリプロピレングリコール（ＢＤＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むものとした。]
[0225] 空の培養槽の滅菌は可能でないため、発酵槽に、リン酸塩、酵母抽出物およびポリプロピレングリコール（７Ｌ容発酵槽では４．２Ｌ、および３０Ｌ容発酵槽では１６Ｌ）を満たし、１２１℃で３０分間インサイチュ滅菌した。滅菌中、一部液体が蒸発した。蒸発による液体の正確な減損量は培地の高さで経験的に評価されるため、滅菌前に過剰量の水を添加した（７Ｌ容発酵槽では０．５Ｌ、および３０Ｌ容発酵槽では１Ｌ）。]
[0226] パラレルで、Ｄ−グルコース一水和物の濃縮溶液（５５０ｇ／Ｌ）とビタミン（塩酸チアミン、ニコチン酸、塩酸ピリドキシンは０．５ｇ／Ｌ、リボフラビンは０．０５ｇ／Ｌ、およびビオチンは０．２ｇ／Ｌ）をＲＯＷに溶解させ、０．２２μｍ孔径膜フィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）に通す濾過によって別々に滅菌し、次いで発酵槽に無菌的に添加し、発酵槽内での適正な終濃度を得た（７Ｌ容発酵槽では：３００ｍＬのＤ−グルコース一水和物、２５ｍＬのビオチン、５ｍＬのビタミン溶液（塩酸チアミン、ニコチン酸、塩酸ピリドキシン）および５０ｍＬのリボフラビン；３０Ｌ容発酵槽では：１０００ｍＬのＤ−グルコース一水和物、１００ｍＬのビオチン、１７ｍＬのビタミン溶液および１７０ｍＬのリボフラビン）。]
[0227] Ｃ）５Ｌおよび２０Ｌ容発酵槽中での培養
ＧＢＳによるｃｐの発現は、細菌病原体の莢膜内の他のものの場合と同様、構成的ではなく、インビトロでの培養中および種々の感染部位から単離された初代培養物において種々である（参考文献１７３）。かかる観察結果にもかかわらず、ＧＢＳにおけるこの表面発現炭水化物抗原の調節についてはほとんどわかっていない。連続式培養における菌体増殖速度は、既に、莢膜多糖の生産を調節する主要因子であることが報告され、ＩＩＩ型莢膜多糖の増殖速度依存性生産は、増殖制限栄養素とは独立して起こった。実際、ｃｐの生産は、菌体を高速（１．４時間−１）の質量倍加時間で保持した方が、低速（１１時間−１）培養よりも多かった（参考文献１７４）。]

权利要求:

請求項1
（ａ）ｃｐを発現する連鎖球菌属菌株の播種材料を準備すること、および（ｂ）該菌株を発酵によって培養することを含み、前記培養は、培養培地への炭素源の線形添加を含み、該培養培地のｐＨをモニタリングすることにより該培養を制御するためのアルゴリズムを使用しない、製造規模での莢膜多糖（ｃｐ）の生産のための連鎖球菌属の培養方法。
請求項2
さらに、莢膜多糖を回収する工程（ｃ）を含む、請求項１に記載の方法。
請求項3
前記連鎖球菌属菌株が、さらにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
請求項4
前記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ菌株が０９０、Ｈ３６ｂ、ＣＢＪ１１１、またはＭ７８１である、請求項３に記載の方法。
請求項5
前記播種材料の光学密度（ＯＤ）が約０．６と約１．８の間である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
請求項6
前記培養培地のｐＨが約６．０と約７．５の間である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
請求項7
前記ｐＨが約７．３である、請求項６に記載の方法。
請求項8
前記培養培地の温度が約３４℃と約３８℃の間である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
請求項9
前記温度が約３６℃である、請求項８に記載の方法。
請求項10
前記炭素源が、さらにグルコースを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
請求項11
前記培養が、さらに、ＯＤが指定レベルに達したら前記炭素源の線形添加が開始されるように培養培地のＯＤをモニタリングすることを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
請求項12
前記指定レベルが、ｃｐの高容積生産が達成されるように選択される、請求項１１に記載の方法。
請求項13
前記指定レベルが約９．８と約１０．２の間である、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
請求項14
前記指定レベルが約１０である、請求項１３に記載の方法。
請求項15
前記培養が、さらに、ＯＤが第１および第２の即時添加レベルに達したら、前記炭素源の線形添加の前に酵母抽出物の２回の即時添加が開始されるように培養培地のＯＤをモニタリングすることを含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
請求項16
前記第１および第２の即時添加レベルが、ｃｐの高容積生産が達成されるように選択される、請求項１５に記載の方法。
請求項17
前記第１の即時添加レベルが約２．８と約３．２の間である、請求項１６に記載の方法。
請求項18
前記第１の即時添加レベルが約３．０である、請求項１７に記載の方法。
請求項19
前記第２の即時添加レベルが約４．３と約４．７の間である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
請求項20
前記第２の即時添加レベルが約４．５である、請求項１９に記載の方法。
請求項21
前記培養培地が、リン酸源、ミネラル源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む規定培地であり、前記ビタミン源が以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される６種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
請求項22
前記培養培地が、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む複合培地であり、前記ビタミン源が以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される４種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
請求項23
連鎖球菌属菌株、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む培養培地であって、前記ビタミン源が以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸から選択される６種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、培養培地。
請求項24
前記連鎖球菌属がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅである、請求項２３に記載の培養培地。
請求項25
前記リン酸源が、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４・Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、またはＮａＣｌからなる、請求項２３または請求項２４に記載の培養培地。
請求項26
前記炭素源がグルコースである、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の培養培地。
請求項27
前記ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの６種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
請求項28
前記ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの５種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
請求項29
前記ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの４種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
請求項30
前記ビタミン源が、以下の７種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、リボフラビン、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシンおよび葉酸のうちの３種類以下からなり、２種類はパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドでなければならない、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
請求項31
前記ビタミン源がパントテン酸カルシウムとナイアシンアミドからなる、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の培養培地。
請求項32
前記アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１９種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、請求項２３〜３１のいずれか１項に記載の培養培地。
請求項33
前記アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１８種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、請求項２３〜３１のいずれか１項に記載の培養培地。
請求項34
前記アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１７種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、請求項２３〜３１のいずれか１項に記載の培養培地。
請求項35
前記アミノ酸源が、以下の１９種類のアミノ酸のリスト：アラニン、アルギニン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アスパラギン酸、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンのうちの１６種類以下からなり、１５種類は、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンでなければならない、請求項２３〜３１いずれか１項に記載の培養培地。
請求項36
前記アミノ酸源が、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、バリン、塩酸システイン、グルタミン酸、およびチロシンからなる、請求項２３〜３１いずれか１項に記載の培養培地。
請求項37
連鎖球菌属菌株、酵母抽出物、リン酸源、炭素源、ビタミン源、および任意選択で連鎖球菌属を増殖させるアミノ酸源を含む培養培地であって、前記ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される４種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、培養培地。
請求項38
前記連鎖球菌属がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅである、請求項３７に記載の培養培地。
請求項39
前記ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される４種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、請求項３７または請求項３８に記載の培養培地。
請求項40
前記ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される３種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、請求項３７または請求項３８に記載の培養培地。
請求項41
前記ビタミン源が、以下の５種類のビタミンのリスト：ビオチン、ナイアシンアミド、リボフラビン、塩酸チアミンおよび塩酸ピリドキシンから選択される２種類以下のビタミンからなり、該ビタミンのうち１種類はビオチンでなければならない、請求項３７または請求項３８に記載の培養培地。
請求項42
前記ビタミン源がビオチンからなる、請求項３７または請求項３８に記載の培養培地。
請求項43
付着性フィルターを用いた濾過工程を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅから莢膜多糖を精製するための方法。
請求項44
前記莢膜多糖を沈殿させるためのカチオン系デタージェント処理工程、その後の該莢膜多糖の再可溶化工程を含まない、請求項４３に記載の方法。
請求項45
前記付着性フィルターがタンパク質付着性フィルターである、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
請求項46
前記付着性フィルターがカーボンフィルターである、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
請求項47
付着性フィルターを用いた濾過工程の前に、以下の工程：（ｉ）夾雑タンパク質および／または核酸のアルコール沈殿；ならびに（ｉｉ）ダイアフィルトレーションを行なう、請求項４３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
請求項48
付着性フィルターを用いた濾過工程の後に、以下の工程：（ｉｖ）再−Ｎ−アセチル化；（ｖ）ダイアフィルトレーションを行なう、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
請求項49
（ａ）莢膜多糖を含む粗製分離物を準備すること；（ｂ）該粗製分離物をアルコール溶液と接触させることによって形成されたアルコール沈殿物を取り出すこと；（ｃ）莢膜多糖を保持したまま低分子量化合物を除去するために濾過すること；および（ｄ）タンパク質付着性フィルターを用いてタンパク質夾雑物を除去し、精製莢膜多糖を生成することを含む、精製莢膜多糖の生産方法。
請求項50
さらに、前記精製莢膜多糖を再−Ｎ−アセチル化する工程（ｅ）を含む、請求項４９に記載の方法。
請求項51
さらに、前記精製莢膜多糖を沈殿させる工程（ｆ）を含む、請求項５０に記載の方法。
請求項52
さらに、前記莢膜多糖を一成分として有するワクチンを製剤化する工程（ｇ）を含む、請求項５１に記載の方法。
請求項53
工程（ｂ）が、核酸夾雑物を沈殿させるが莢膜多糖は沈殿させないのに充分な濃度までアルコール溶液を添加することを含む、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の方法。
請求項54
前記アルコール溶液がエタノールを含む、請求項５３に記載の方法。
請求項55
前記アルコール溶液が、さらにＣａＣｌ２を含む、請求項５３または請求項５４に記載の方法。
請求項56
前記アルコール溶液が約１０％と約５０％の間のエタノール濃度まで添加される、請求項５４または請求項５５に記載の方法。
請求項57
前記アルコール溶液が約３０％のエタノール濃度まで添加される、請求項５６に記載の方法。
請求項58
前記タンパク質付着性フィルターが活性炭フィルターである、請求項４９〜５７のいずれか１項に記載の方法。